Nyheder

Tak fordi du besøger Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Kræftceller har udviklet forskellige mekanismer til at overvinde cellulær stress og fortsætte med at udvikle sig.Proteinkinase R (PKR) og dets proteinaktivator (PACT) er de første respondere, der overvåger forskellige stresssignaler, der fører til hæmning af celleproliferation og apoptose.Imidlertid forbliver reguleringen af ​​PACT-PKR-vejen i cancerceller stort set ukendt.Her fandt vi, at lang ikke-kodende RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) er direkte involveret i hæmningen af ​​PACT-PKR-vejen og fremmer cancercelleproliferation.Ved hjælp af storstilet funktionel screening af CRISPRi 971 cancerassocieret lncRNA fandt vi ud af, at DARS-AS1 var forbundet med signifikant forbedret cancercelleproliferation.Derfor hæmmer DARS-AS1 knockout celleproliferation og fremmer cancercelleapoptose i forskellige cancercellelinjer in vitro og reducerer tumorvækst markant in vivo.Mekanisk binder DARS-AS1 direkte til PACT-aktiveringsdomænet og forhindrer PACT-PKR-interaktion og reducerer derved PKR-aktivering, eIF2α-phosphorylering og hæmmer apoptotisk celledød.Klinisk er DARS-AS1 bredt udtrykt i flere cancerformer, og overekspression af dette lncRNA er tegn på en dårlig prognose.Denne undersøgelse belyser cancerspecifik regulering af PACT-PKR-vejen af ​​DARS-AS1 lncRNA og giver et andet mål for cancerprognose og behandling.
Evnen til at tilpasse sig stress er en vigtig egenskab for kræftcellers overlevelse og spredning.Den hurtige spredning og metaboliske kendetegn ved kræft topper i barske mikromiljøer - næringsstofmangel, hypoxi og lav pH - som kan udløse signalveje for celledød.Dysregulering af stressfølsomme gener såsom p535, varmechokproteiner 6, 7, KRAS8, 9 og HIF-110, 11, 12, 13 observeres hyppigt i cancer, hvilket blokerer apoptose og fremmer overlevelse.
Proteinkinase R (PKR) er en vigtig stresssensor og subunit-kinase af eukaryotisk initieringsfaktor 2α (eIF2α), en translationsregulator, der forbinder cellulær stress med celledød.PKR blev oprindeligt identificeret som et antiviralt protein ved påvisning af et fremmed dobbeltstrenget RNA (dsRNA).Ved aktivering phosphorylerer PKR eIF2α for at hæmme viral og cellulær proteinsyntese14,15,16.PACT (PKR-aktivatorprotein) er blevet identificeret som det første PKR-aktivatorprotein i fravær af dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Gennem direkte interaktion med PKR transducerer PACT forskellige belastninger (serumsult, peroxid- eller arsenitbehandling) til PKR og nedstrøms signalveje.Ud over eIF2α-phosphorylering udløser PACT-medieret PKR-aktivering forskellige hændelser forbundet med stressresponset, herunder ændret redoxstatus via PI3K/Akt24-vejen, forbedret DNA-skadekontrol via p5325,26 og NF-κB27,28 Regulerer transkription, 29. På grund af deres kritiske rolle i stressrespons, spredning, apoptose og andre centrale cellulære processer er PKR og PACT lovende terapeutiske mål for mange sygdomme, især cancer30,31,32,33.På trods af denne pleiotrope funktionelle og biologiske betydning forbliver reguleringen af ​​PACT/PKR-aktivitet i cancerceller imidlertid uhåndgribelig.
lncRNA'er er transkripter større end 200 nukleotider uden protein-kodende potentiale.Siden banebrydende hele genom-sekventeringsprojekter har identificeret tusindvis af lncRNA'er,35,36 er der gjort en stor indsats for at belyse deres biologiske funktioner.En voksende mængde forskning har vist, at lncRNA'er er involveret i mange biologiske processer37, herunder regulering af X-kromosominaktivering38,39, prægning40, transkription41,42, translation43 og endda cancervækst44,45,46,47.Disse undersøgelser rapporterede, at mange lncRNA'er er involveret i PACT/PKR-vejen.En sådan undersøgelse viste, at lncRNA ASPACT hæmmede PACT-transkription og øgede nuklear retention af PACT-mRNA.Andre undersøgelser har vist, at lncRNA nc886 binder til PKR og hæmmer dets phosphorylering49,50.Indtil videre er lncRNA, der regulerer PACT-medieret PKR-aktivering, ikke blevet rapporteret.
Aspartyl-tRNA syntetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) er blevet identificeret som et onkogent lncRNA51,52,53,54.Gennem reguleringen af ​​miP-194-5p53, miP-12952 og miP-532-3p51 har DARS-AS1 vist sig at fremme væksten af ​​henholdsvis klarcellet nyrecellekarcinom, skjoldbruskkirtelcarcinom og ikke-småcellet lungekarcinom.Tong og kolleger fandt også, at DARS-AS1 fremmer myelomprogression ved at opretholde stabiliteten af ​​protein 39 (RBM39) RNA-bindende motiv.Der er dog ikke udført undersøgelser af, hvorvidt dette lncRNA er involveret i reguleringen af ​​PACT-PKR-aktivering og stressreaktionen af ​​cancerceller.
Her udførte vi en storstilet skærm med tab af funktion ved hjælp af CRISPRI-systemet og fastslog, at DARS-AS1 lncRNA fremmer spredningen af ​​flere typer kræftceller.Derudover har vi identificeret en hovedmekanisme: DARS-AS1 binder direkte til PACT, hæmmer PACT- og PKR-binding, forhindrer phosphorylering af eIF2α, et lavere PKR-substrat, og i sidste ende hæmmer apoptotisk celledød.Som konklusion afslører vores arbejde DARS-AS1 lncRNA som en regulator af PACT-PKR-vejen og et potentielt mål for kræftbehandling og prognose.
Omfattende genomiske profileringsundersøgelser har identificeret hundredvis af lncRNA'er forbundet med cancer.Deres funktion er dog stort set ukendt56.For at identificere lovende lncRNA-kandidater involveret i cancerprogression udførte vi en funktionstabsskærm for reduceret spredning i SW620 kolorektal cancercellelinien ved hjælp af CRISPRi-systemet (fig. 1a).Det unikke ved SW480 og SW620 tyktarmskræftcellelinjerne er, at de er afledt af primære og sekundære tumorer hos en enkelt patient.Dette giver en værdifuld sammenligning til at studere genetiske ændringer i progressionen af ​​fremskreden tyktarmskræft.Derfor analyserede vi transkriptomerne af kolorektale cancercellelinjer (SW480 og SW620) ved hjælp af RNA-sekventering og indsamlede nogle potentielle funktionelle lncRNA'er fra den publicerede litteratur.Baseret på disse resultater designede vi et poolet sgRNA-bibliotek indeholdende 7355 sgRNA-oligoer målrettet mod 971 cancerassocierede lncRNA'er og 500 ikke-målrettede sgRNA-oligoer til en negativ kontrol (Supplerende data 1).
Skematisk repræsentation af screening ved hjælp af CRISPRi-systemet.b sgRNA berigelse efter screening.Den vandrette stiplede linje repræsenterer log2 (foldændring) = ±0,58.Den lodrette stiplede linje angiver p-værdi = 0,05.Sorte prikker repræsenterer ikke-mål sgRNA (benævnt NC).Røde prikker er sgRNA'er rettet mod DARS-AS1.Blå prikker er sgRNA'er rettet mod LINC00205, et tidligere beskrevet onkogent lncRNA.fold forandring = (normaliseret aflæsning, dag 17)/(normaliseret aflæsning, dag 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown hæmmede cellevækst.Fejlbjælker repræsenterer ± standardafvigelse af de tre eksperimenter.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tosidet Elevens t-test.d DARS-AS1-ekspression i tumorer (TCGA-datasæt).em Ekspression af DARS-AS1 i parrede normale prøver og tumorprøver fra patienter med henholdsvis BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP og COAD (TCGA-datasæt).p-værdier blev opnået ved hjælp af parret to-halede Students t-test.
Efter konstruktion af plasmidet og emballering af lentivirus, transducerede vi dCas9-SW620 kolorektal cancercellelinje med ovenstående bibliotek i fire uafhængige infektionsforsøg.Infektionsmangfoldigheden (MOI) for disse infektioner var 0,1-0,3, hvilket indikerer, at hver celle kun kan transficeres med ét sgRNA.Efter 18 dages in vitro-dyrkning faldt eller steg berigelsesprofilen af ​​mål-sgRNA'er efter screening, mens antallet af ikke-målrettede kontrololigonukleotider forblev relativt uændret sammenlignet med præ-screeningsprofilen, hvilket indikerer, at vores mål har en meget screeningsspecifik bibliotek.Ris.1b og supplerende tabel 1). LINC00205, som tidligere blev rapporteret at fremme lungekræft og leverkræftprogression58,59,60, blev screenet ud (log2 (foldændring) <-0,58, p-værdi <0,05), hvilket bekræfter pålideligheden af ​​denne screening (fig. 1b). LINC00205, som tidligere blev rapporteret at fremme lungekræft og leverkræftprogression58,59,60, blev screenet ud (log2 (foldændring) <-0,58, p-værdi <0,05), hvilket bekræfter pålideligheden af ​​denne screening (fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, der tidligere er rapporteret at fremme progressionen af ​​lungekræft og leverkræft58,59,60, blev udelukket (log2 (fold ændring) <-0,58, p-værdi <0,05), hvilket bekræfter robustheden af ​​denne screening (fig. 1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, tidligere rapporteret at fremme lunge- og leverkræftprogression58,59,60, blev udelukket (log2 (fold ændring) <-0,58, p-værdi <0,05), hvilket bekræfter robustheden af ​​denne screening (fig. 1b).
Blandt alle testede lncRNA'er blev DARS-AS1 også screenet med de tre beslægtede sgRNA-oligonukleotider signifikant reduceret efter 18 dages dyrkning, hvilket tyder på, at knockdown af dette lncRNA resulterede i reduceret cancerproliferation (fig. 1b).Dette resultat blev yderligere understøttet af MTS-analyse i kolorektale cancerceller, der viste, at væksthastigheden af ​​DARS-AS1 knockdown-celler kun var halveret sammenlignet med kontrolceller (figur 1c) og var i overensstemmelse med tidligere rapporter om flere andre cancertyper.: klarcellet nyrekræft, skjoldbruskkirtelkræft og ikke-småcellet lungekræft51,52,53,55.Imidlertid forbliver dens funktion og molekylære mekanismer i kolorektal cancer uudforsket.Derfor valgte vi dette lncRNA til yderligere undersøgelse.
For at studere DARS-AS1-ekspression hos patienter analyserede vi omfattende 10.327 tumorprøver fra Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet.Vores resultater viser, at DARS-AS1 er bredt udtrykt og signifikant opreguleret i raske celler i en række forskellige tumorer, herunder tyktarmsadenocarcinom (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC) og renal papillary cell carcinoma (KIRP)..Meget få (fig. 1d og supplerende fig. 1a, b). Analyse af parrede raske/tumorprøver bekræftede yderligere en signifikant højere ekspression af DARS-AS1 i tumorer af blære-urothelial carcinoma (BLCA), nyre renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinom (PRAD), lungepladecellecarcinom (LUSC) , uterine corpus endometriecarcinom (UCEC), lungeadenokarcinom (LUAD), lever hepatocellulært carcinom (LIHC), nyrepapillærcellekarcinom (KIRP) og colonadenokarcinom (COAD) (p-værdi < 0,05) (fig. 1e–m) . Analyse af parrede raske/tumorprøver bekræftede yderligere en signifikant højere ekspression af DARS-AS1 i tumorer af blære-urothelial carcinoma (BLCA), nyre renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinom (PRAD), lungepladecellecarcinom (LUSC) , uterine corpus endometriecarcinom (UCEC), lungeadenokarcinom (LUAD), lever hepatocellulært carcinom (LIHC), nyrepapillærcellekarcinom (KIRP) og colonadenokarcinom (COAD) (p-værdi < 0,05) (fig. 1e–m) .Analyse af parrede raske/tumorprøver bekræftede også signifikant højere ekspression af DARS-AS1 i blæreurothelial carcinom (BLCA), clear cell renal og renal cell carcinoma (KIRC), prostata adenokarcinom (PRAD), lungepladecellecarcinom (LUSC) tumorer., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometriecarcinom i corpus uteri (UCEC), adenocarcinom i lungen (LUAD), hepatocellulært carcinom i leveren (LIHC), papillærcellecarcinom i nyren (KIRP) og adenocarcinom i tyktarmen (COAD) (p værdi < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 、 、 膀胱 尿路 尿路 尿路 上 上 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路Å <0,05）（图1e-m）.配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌)癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analyse af raske/tumorparrede prøver understøttede yderligere DARS-AS1's rolle i blæreurothelial carcinom (BLCA), clear cell renal cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinom (PRAD) og lunge pladecellecarcinom (LUSC) tumorer.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspression i corpus uterint carcinom (UCEC), lungeadenokarcinom (LUAD), hepatocellulært karcinom (LIHC), nyrepapillærcellecarcinom (KIRP) og colonadenokarcinom (COAD) (p-værdi <0,05) (figur 1e -m).Tilsammen indikerer disse resultater, at DARS-AS1 er bredt og højt udtrykt i en række kræftformer.
Fordi DARS-AS1 og DARS (genet, der koder for antisense-strengen) deler den samme promotor og er placeret ved siden af ​​hinanden, designede vi shRNA til specifikt at slå DARS-AS1 ned, men ikke DARS (Supplerende Fig. 2a,b og Supplerende Tabel 2). .Ud over SW620 brugte vi også tre andre cellelinjer, der i høj grad udtrykker DARS-AS1 til at studere effektiviteten og funktionen af ​​shRNA knockdown (Supplerende tabel 3).Vores resultater indikerede, at alle tre udviklede shRNA'er opnåede mindst 80% DARS-AS1 knockdown effektivitet med ringe effekt på mængden af ​​DARS mRNA (Supplerende Fig. 2c-f).Derudover fandt vi, at DARS-AS1 knockdown med disse shRNA'er signifikant hæmmede cellevækst i kolorektale cancercellelinjer SW620 (49,7%) og HCT116 (27,7%), brystcancercellelinje MBA-MD-231 (53,4%).) og HepG2-hepatomcellelinjen (92,7 % reduktion), såvel som deres evne til at danne uforankrede sfærer (gennemsnitlig reduktion på ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % og 75,7 % pr. cellelinje) (fig. 2a,b).I SW620 bekræftede resultaterne af kolonidannelsesassayet yderligere, at DARS-AS1 shRNA signifikant hæmmede celleproliferation med et gennemsnitligt fald på ca. 69,6% (fig. 2c).
Effekt af kontrol shRNA og DARS-AS1 shRNA på celleproliferation (a) og sfæroiddannelse (b) i SW620, HCT116, MBA-MD-231 og HepG2 celler.c Effekt af kontrol shRNA og DARS-AS1 shRNA på kolonidannelse i SW620 celler.Celleproliferation (d), sfæroiddannelse (e) og kolonidannelse (f) af SW620-celler, der overudtrykker DARS-AS1.De viste data er middelværdien ± standardafvigelsen for tre eksperimenter.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 og *** p ≤ 0,001 ved tosidet Students t-test.
For at supplere undersøgelser med tab af funktion, skabte vi derefter SW620-celler, der overudtrykker DARS-AS1 (Supplerende Fig. 2g).DARS-AS1-overekspression øgede signifikant cellevækst (1,8 gange), uforankret sfæroiddannelse (1,4 gange) og kolonidannelse (3,3 gange) i SW620-celler (fig. 2d-f).Vi bekræftede dette resultat ved hjælp af en anden DARS-AS1-udtrykkende cellelinje, A549.Denne øgede celleproliferation på grund af DARS-AS1-overekspression blev yderligere observeret i A549-celler (Supplerende Fig. 2h, i og Supplerende Tabel 3).Tilsammen viser disse gevinst- og tabsundersøgelser, at DARS-AS1 fremmer cancercelleproliferation in vitro.
For at udforske den underliggende mekanisme, hvormed DARS-AS1 regulerer celleproliferation, udførte vi en RNA pull-down analyse for at identificere dets potentielle proteinbindende partnere.RT-qPCR-resultater viste, at omkring 86,2% af DARS-AS1 er placeret i cytoplasmaet af SW620-celler (Supplerende Fig. 3a).Det in vitro-transskriberede biotinylerede DARS-AS1 eller pseudoRNA blev derefter inkuberet med SW620-cellelysater efterfulgt af SDS-PAGE-separation.Efterfølgende sølvfarvning viste, at et distinkt bånd (~38 kDa) var signifikant beriget i DARS-AS1 pull-prøver, men ikke i dummy-RNA- eller perleprøver (fig. 3a).Dette bånd blev identificeret som et PKR-aktiverende protein (PACT) ved massespektrometri (MS) og yderligere bekræftet ved immunoblotting i SW620-, HCT116- og HepG2-cellelinjer (fig. 3a, b).Berigelsen af ​​DARS og relaterede PACT-proteiner - PKR og TRBP - blev også undersøgt ved hjælp af RNA-analyse ved Western blotting (WB).Resultaterne viste, at der ikke blev fundet nogen direkte interaktion mellem DARS-AS1 RNA og disse tre proteiner (Supplerende Fig. 3b).Den specifikke interaktion mellem DARS-AS1 og PACT blev yderligere bekræftet af RNA-immunpræcipitation (RIP)-analyse, som viste, at DARS-AS1 var signifikant beriget i anti-PACT-antistoffer, men ikke andre kontrol-RNA'er (figur 3c).For at bestemme, om DARS-AS1 interagerer direkte med PACT i fravær af andre cellulære komponenter, blev en in vitro biolagsinterferometri (BLI) assay udført ved anvendelse af oprenset PACT.Biotin-mærket DARS-AS1 eller dummy RNA blev immobiliseret på streptavidin (SA) biosensorer og derefter inkuberet i kinetisk buffer indeholdende 1 μM PACT.Navnlig bandt PACT stærkt til DARS-AS1 (KD-værdi ~26,9 nM), men ikke for at efterligne RNA (figur 3d).Tilsammen viser disse resultater en direkte interaktion og høj affinitet mellem DARS-AS1 og PACT.
RNA pull-analyse identificerede DARS-AS1, der interagerer med PACT i SW620-celler.Ovenfor sølvfarvning af relaterede proteiner.Lavere immunoblots blev udført med anti-PACT-antistof.b RNA pull-down analyse blev udført i HCT116 (øverst) og HepG2 (nederst) celler.PACT-berigelse blev påvist ved immunblotting.cRNA-immunpræcipitation (RIP)-assays blev udført i SW620-celler under anvendelse af de angivne antistoffer.d PACT-bindingskurver til DARS-AS1 eller kontrol-RNA i fuld længde blev opnået ved anvendelse af biolagsinterferometri (BLI).RNA blev immobiliseret på en streptavidin biosensor.1 μM PACT blev brugt til at måle association.RNA pull-assayet blev udført under anvendelse af biotinyleret DARS-AS1 i fuld længde eller trunkeret (øverst).Immunoblot, der viser PACT modtaget (nederst).f Oprenset mærket PACT blev inkuberet med biotinyleret DARS-AS1 i fuld længde eller trunkeret (som i e) til in vitro RIP-assay.Det ekstraherede RNA blev verificeret ved RT-qPCR.g Den relative affinitet af forskellige RNA-fragmenter til PACT blev opnået ved anvendelse af biolagsinterferometri.Til analyse blev 100 nM RNA og 1 μM RAST brugt.h In vitro RIP-assays blev udført under anvendelse af oprenset intakt eller trunkeret mærket PACT.Det ekstraherede RNA blev verificeret ved RT-qPCR.i Væksthastighed af SW620-celler, der overudtrykker DARS-AS1, PACT eller begge dele.j Overekspression af fuld-længde eller trunkeret DARS-AS1 i SW620-celler havde forskellige virkninger på cellevækst.k Apoptose blev påvist ved immunblotting med anti-PARP-antistof.l Knockout af DARS-AS1 inducerer apoptose af SW620-celler som vist ved flowcytometri.De viste data er middelværdien ± standardafvigelsen for tre eksperimenter. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ved tosidet Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ved tosidet Students t-test.
Vi genererede derefter tre biotinylerede DARS-AS1 RNA-fragmenter ved in vitro-transkription for at identificere DARS-AS1-regionen, der kræves til PACT-associering (figur 3e).RNA-analyseresultaterne viste, at hvert fragment var i stand til at interagere med PACT, men den 3'-terminale region (384-768 nukleotider mærket A3) viste mere end 1-384 nukleotider mærket A1) (fig. 3e).Lignende resultater blev observeret i in vitro RIP-assayet under anvendelse af rekombinant PACT (figur 3f).I overensstemmelse med disse resultater viste eksperimenter til at binde immobiliserede RNA-fragmenter til PACT ved hjælp af BLI også, at PACT har en højere affinitet for A3 (384-768 nt) (KD-værdi på ca. 94,6 nM), mens næsten ingen forbindelser med andre områder.(fig. 3d).
Vi undersøgte også de associerede bindingsregioner i PACT.PACT indeholder tre funktionelle domæner, hvoraf to er konserverede dobbeltstrengede RNA-bindende domæner (dsRBD) og et tredje domæne (betegnet D3), der fungerer som en aktivator af proteininteraktioner.For at undersøge lncRNA-bindingskapaciteten af ​​hvert domæne konstruerede vi tre mutationer, der fjernede hvert af de tre domæner og udførte et in vitro RIP-assay.Vores resultater viste, at deletion af det tredje domæne (D3) af PACT signifikant reducerede dets interaktion med DARS-AS1 (med 0,11 gange sammenlignet med intakt PACT) sammenlignet med de to andre mutationer (fig. 3h), det blev vist, at frigivelsen af D3 interageret med DARS.-AC1.Tilsammen tyder disse resultater på, at interaktion mellem DARS-AS1 og PACT primært kan forekomme gennem 3'-enden af ​​DARS-AS1 og D3-domænet af PACT.
Vi bemærkede, at DARS-AS1 ikke havde nogen effekt på PACT-ekspression, og PACT havde ingen effekt på DARS-AS1 (Supplerende Fig. 3c).Vi undersøgte derefter effekten af ​​PACT knockdown på cellevækst.I modsætning til DARS-AS1 voksede relative celler 1,5-3 gange hurtigere, når PACT blev slået ned (Supplerende Fig. 3d).Resultaterne af kolonidannelsesassayet indikerede, at cellerne dannede 2-3 gange kolonier efter shRNA-behandling med PACT (Supplerende Fig. 3e).For at teste, om DARS-AS1 regulerer celleproliferation gennem PACT, genererede vi SW620-celler, der overudtrykker PACT, DARS-AS1 eller begge dele.Overekspression af PACT viste signifikant inhibering af celleproliferation (figur 3i).Mens DARS-AS1-overekspression i sig selv signifikant fremmede celleproliferation, var der ingen signifikant forskel i væksthastigheden af ​​celler, der overudtrykte DARS-AS1 og PACT.Disse resultater tyder på, at PACT kan modvirke den øgede spredning forårsaget af DARS-AS1 overekspression.
Da forskellige regioner af DARS-AS1 har forskellige PACT-bindende evner, undersøgte vi deres relative indflydelse på celleproliferation ved forskellig overekspression af DARS-AS1-fragmenter.Sammenlignet med de to andre fragmenter blev DARS-AS1 overudtrykt i 3'-enden (384-768 nt), den vigtigste PACT-relaterede region i DARS-AS1, som havde den højeste evne til at stimulere celleproliferation (fig. 3j).Disse resultater indikerer en positiv sammenhæng mellem bindingskapaciteten og den biologiske funktion af DARS-AS1.
PACT er blevet rapporteret at være et pro-apoptotisk protein19.Derfor undersøgte vi effekten af ​​DARS-AS1 på apoptose.Som forventet øgede DARS-AS1 knockdown signifikant PARP-spaltning i SW620-celler og øgede andelen af ​​annexin V-positive celler i SW620-, HCT116-, HepG2- og MBA-MD-231-cellelinjer (fig. 3k).3).3f–h), hvilket indikerer, at den anti-apoptotiske virkning af DARS-AS1 i kræftceller er modsat den apoptoseinducerende funktion af PACT.Tilsammen tyder disse resultater på, at mekanismen for DARS-AS1 onkogen funktion kan være gennem hæmning af PACT-funktionen.
Dernæst undersøgte vi de funktionelle implikationer af DARS-AS1-PACT-foreningen.PACT er blevet rapporteret at aktivere PKR gennem direkte interaktion, som efterfølgende øger eIF2α-phosphorylering, hvilket forårsager translationel deletion og apoptose17.Først undersøgte vi, om DARS-AS1 påvirker den cellulære lokalisering af PACT og PKR.Konfokal fluorescensmikroskopi viste, at PACT og PKR var stærkt kolokaliseret i SW620-celler med en gennemsnitlig Pearson-korrelationskoefficient på 0,72.I mellemtiden reducerede DARS-AS1-overekspression signifikant PACT- og PKR-co-lokalisering (gennemsnitlig Pearson-korrelationskoefficient 0,61) (figur 4a).For at undersøge, om DARS-AS1 kunne modulere PACT-PKR-interaktionen, udførte vi en co-immunpræcipitation (co-IP) assay med anti-PACT-antistof i SW620-cellelysater.PKR var stærkt beriget med anti-PACT i kontrolceller, mens PKR-genvinding var signifikant reduceret i lysater fra celler, der overudtrykte DARS-AS1 (fig. 4b).Oprenset mærket PACT og PKR blev anvendt til in vitro proteinbindingsassays.Følgelig viste dem, der gav DARS-AS1, men ingen kontrol-RNA, undertrykt PACT-PKR-interaktion (figur 4c).Alle resultater viste, at DARS-AS1 forstyrrede PACT- og PKR-kommunikationen.
en Co-lokalisering af PACT og PKR i kontrolceller eller celler, der overudtrykker DARS-AS1, blev observeret ved anvendelse af konfokal fluorescensmikroskopi.Kernerne blev farvet med DAPI.Statistiske resultater blev opnået fra 16 fotografier.b Co-immunpræcipitation (co-IP) ved hjælp af anti-PACT-antistof i cellelysater af kontrol SW620-celler eller celler, der overudtrykker DARS-AS1.c Mærket PACT, oprenset PKR og transskriberet in vitro med DARS-AS1 eller falsk RNA blev inkuberet til in vitro proteinbindingsanalyse.Anti-flag-antistoffer blev anvendt til immunpræcipitation.d Immunoblots med de angivne antistoffer blev udført i SW620- og HCT116-celler transficeret med kontrol-shRNA eller DARS-AS1-shRNA efterfulgt af serumsult.e DARS-AS1 ekspressionsniveauer ændrede cellulær følsomhed over for thapsigargin.SW620-celler blev transficeret med DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overekspressionsplasmid eller kontrolplasmid.Celler blev behandlet med thapsigargin i 48 timer, og cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af MTS-reagenset.f In vitro transskriberet DARS-AS1 eller dummy RNA og oprenset PACT blev brugt til in vitro aktiveringsassay og immunoblotdetektion.g Immunoblots under anvendelse af disse antistoffer blev udført på SW620-ctrl-celler (venstre) eller celler, der overudtrykker PKR-mutanter (højre).Disse celler blev derefter transficeret med kontrol shRNA eller DARS-AS1-shRNA efterfulgt af serum sult.h Flowcytometri viste, at inaktivering af mutant PKR kompenserede for DARS-AS1-induceret apoptose i SW620-celler.i Immunoblots med de angivne antistoffer blev udført i SW620 (venstre) eller HCT116 (højre) celler.Celler transficeret med kontrol shRNA eller DARS-AS1 shRNA er serum-depriverede og suppleret med 100 nM PKR C16 inhibitor eller DMSO.Målestok = 5 µm.De viste data er middelværdien ± standardafvigelsen for tre eksperimenter.* p ≤ 0,05 tosidet Students t-test.
Det antages generelt, at når først PACT interagerer med PKR17, kan PKR-phosphorylering ved Thr451 induceres.Vores resultater indikerede, at niveauet af PKR-phosphorylering var signifikant forhøjet i DARS-AS1 knockdown-celler efter serumsult (Fig. 4d og Supplerende Fig. 4a).I overensstemmelse hermed fandt vi, at phosphorylering af eIF2α, hoved-PKR-substratet, også blev signifikant forøget af DARS-AS1 shRNA (fig. 4d og supplerende fig. 4a).Thapsigargin er en ER-stressor, der får ER til at frigive Ca2+.Behandling med thapsigargin er blevet rapporteret at inducere ekspression og aktivering af PACT, som yderligere interagerer med og aktiverer PKR, hvilket fører til apoptose ved at øge eIF2α-phosphorylering 18,61.Her brugte vi thapsigargin som en stimulator af PACT/PKR-vejen til at undersøge, om DARS-AS1 kan hjælpe celler med at overvinde stress ved at hæmme PACT/PKR-vejen.Vi observerede, at niveauet af DARS-AS1-ekspression korrelerede positivt med celleresistens over for thapsigargin.SW620-celler, der overudtrykte DARS-AS1, overlevede bedre, når de blev behandlet med thapsigargin, mens celler med DARS-AS1-knockdown blev mere modtagelige (fig. 4e).I overensstemmelse med disse resultater reducerede DARS-AS1-overekspression thapsigargin-induceret PKR-phosphorylering (Supplerende Fig. 4b).I modsætning hertil blev PKR og eIF2α efter thapsigargin-behandling phosphoryleret i højere grad i DARS-AS1 knockdown-celler sammenlignet med kontrolceller (Supplerende Fig. 4b).Interessant nok inducerede thapsigargin DARS-AS1-ekspression på en dosisafhængig måde, hvilket kan indikere en anti-stress-funktion af DARS-AS1 (Supplerende Fig. 4c).Derudover udførte vi in ​​vitro aktiveringsassays for at bekræfte disse observationer.Kort fortalt blev PKR oprenset fra cellelysater under anvendelse af et anti-PKR-antistof, derefter inkuberet med rekombinant PACT og DARS-AS1 transskriberet in vitro.Efter den enzymatiske reaktion blev phospho-PKR påvist under anvendelse af WB.Vores resultater indikerede, at PKR-phosphorylering blev signifikant hæmmet af DARS-AS1, men ikke af kontrol-RNA (figur 4f).Disse in vitro og in vivo resultater tyder på, at DARS-AS1 hæmmer PACT-medieret PKR-aktivering.Samtidig observerede vi også et fald i PACT-gendannelse i nærvær af DARS-AS1 (figur 4f).Dette resultat er i overensstemmelse med resultaterne af in vitro proteinbindingsassayet (figur 4c) og illustrerer igen blokeringsfunktionen af ​​DARS-AS1 for PACT-PKR association.
Ser246 og Ser287 i D3-domænet af PACT er påkrævet til PKR-aktivering under cellulært stress.Substitution af to serinrester for alanin gav mutant PACT (mutD), som aktiverede PKR i fravær af stress, og substitution for alanin (mutA) omvendte protokollen.Da vi har demonstreret vigtigheden af ​​dette domæne i direkte forbindelse med DARS-AS1, genererede vi disse to PACT-mutanter for at teste, om disse rester også kunne være involveret i interaktion med DARS-AS1.Interessant nok mistede begge mutanter evnen til at binde til DARS-AS1 (Supplerende Fig. 4d), hvilket tyder på, at den komplette struktur af PACT-proteinet kan være nødvendig for effektiv interaktion med DARS-AS1.
Desuden tyder vores resultater også på, at DARS-AS1-shRNA-induceret hæmning af celleproliferation delvist kan genoprettes ved at overudtrykke en dominant negativ PACT-mutant (PACTmutA) eller en dominant negativ PKR-mutant (PKRmut) (Supplerende Fig. 4e. e).Overekspression af dominant-negative PKR-mutanter reducerede PKR-phosphorylering induceret af DARS-AS1-knockdown samt eIF2a-phosphorylering i serum-berøvede celler (fig. 4g).Endnu vigtigere var andelen af ​​apoptotiske celler induceret af DARS-AS1 knockdown også reduceret i celler, der overudtrykte PKRmut (fig. 4h og supplerende fig. 4g).Hæmning af PKR-kinaseaktivitet forringer også DARS-AS1-funktionen, da resultaterne viste, at DARS-AS1-knockdown sjældent udløste PKR- og eIF2α-phosphorylering, når celler blev behandlet med en PKR-specifik C16-hæmmer (fig. 4i og supplerende fig. 4h).).Sammenlagt tyder vores resultater på, at DARS-AS1 fremmer celleproliferation, i det mindste delvist, ved at hæmme PACT-medieret PKR-aktivering.
For yderligere at udforske DARS-AS1's rolle i tumorigenese udførte vi in ​​vivo-eksperimenter ved hjælp af en muse-xenograft-model. Resultater viser, at knockdown af DARS-AS1 dramatisk reducerede tumorvækst i mus (p-værdi < 0,0001) (fig. 5a). Resultater viser, at knockdown af DARS-AS1 dramatisk reducerede tumorvækst i mus (p-værdi < 0,0001) (fig. 5a). RESULTATER показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (nedsat p <0,0001) (5ar). Resultaterne viser, at DARS-AS1 knockdown drastisk reducerer tumorvækst hos mus (p-værdi < 0,0001) (figur 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (nedsat р <0.0001) (5). Resultaterne viste, at DARS-AS1 knockdown signifikant reducerede tumorvækst hos mus (p-værdi < 0,0001) (figur 5a).I DARS-AS1 knockdown-gruppen var der således et signifikant fald i gennemsnitlig tumorvolumen med ca. 72,9% og gennemsnitlig tumormasse med ca. 87,8% (figur 5b-d).Disse resultater tyder stærkt på, at DARS-AS1 signifikant kan fremme tumorvækst in vivo.
Effekter af ad DARS-AS1 knockdown på kolorektal onkogenese hos nøgne mus.Vækstkurver (a), tumorstørrelse (b), vægt (c) og tumorbilleder (d) er vist.Fejlbjælker repræsenterer ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 tosidet Elevens t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 på betalingskort. ****p < 0,0001 tosidet Students t-test.e Kaplan-Meier analyserede sammenhængen mellem DARS-AS1-ekspressionsniveauer og overordnet overlevelse hos patienter med UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM og LGG.Høje niveauer af DARS-AS1-ekspression hos patienter var i de øverste 50 %;det lave niveau af DARS-AS1-ekspression hos patienter var i de nederste 50 %.p-værdier blev bestemt ved hjælp af log rank test.f Foreslået model, hvor DARS-AS1 regulerer PACT-PKR-vejen og tumorvækst.
For bedre at forstå den kliniske virkning af DARS-AS1 undersøgte vi sammenhængen mellem dets udtryk og patientoverlevelse.Ved at analysere TCGA-datasættet fandt vi, at højere DARS-AS1-ekspression var forbundet med uveal melanom (UVM), renal kromofobi (KICH), renal papillærcellecarcinom (KIRP), mesotheliom (MESO), multiplex.Lavere overlevelse var signifikant forbundet med glioblastommorfose (GBM) og patienter med lavgradigt hjernegliom (LGG) (figur 5e).Disse resultater tyder på, at DARS-AS1 kan spille en vigtig rolle i klinisk tumorprogression og kan være en potentiel forudsigelig biomarkør i flere kræftformer.
I denne undersøgelse, ved hjælp af storstilet CRISPRI-funktionel screening, fastslog vi, at DARS-AS1 lncRNA overvinder kræftcellestress ved at regulere to vigtige stressrespondere, PACT og PKR.Ved at interagere direkte med PACT hæmmede DARS-AS1 PACT-medieret PKR-aktivering og forhindrede derved apoptotisk celledød og fremmede celleproliferation (fig. 5f).Opregulering af DARS-AS1 er blevet observeret i flere typer kræft, hvilket tyder på, at dens funktion med at fremme kræftcelleoverlevelse under stressende forhold kan være bredt anvendelig til flere typer kræft.
PACT er blevet identificeret som et PKR-aktivatorprotein, og PACT-medieret PKR-aktivering spiller en vigtig rolle i stressresponser ved at regulere transkription, translation, apoptose og andre vigtige cellulære processer62.I årtier er der blevet gjort forsøg på at forstå den kræftspecifikke regulering af PACT-PKR-kaskaden.Her afslørede vores undersøgelse en anden mekanisme til regulering af PACT-PKR i kræftceller gennem cellulært lncRNA DARS-AS1, som binder direkte til PACT, blokerer PACT-PKR-interaktion, hæmmer PKR-aktivering og eIF2α-phosphorylering, og derved hæmmer stress-induceret apoptose og stimulerer eventuel kræftformering.celler.Denne opdagelse kaster lys over potentielle lncRNA-mål for kræftprognose og terapi.
Vores data viste, at DARS-AS1 knockdown sensibiliserer celler til serumsult med en signifikant stigning i phosphoryleret PKR og eIF2α.Disse resultater tyder på, at DARS-AS1 fremmer cancercelleoverlevelse under barske forhold ved at hæmme PACT/PKR-aktivitet.Adskillige andre ikke-kodende RNA'er, såsom ASPACT og nc886, er også involveret i PACT/PKR-aksen ved at nedregulere PACT48-mRNA eller regulere autophosphorylering ved at binde til PKR49,50,64.Blandt dem fungerer DARS-AS1 som en disruptor af PACT-PKR foreningen.Denne undersøgelse beriger vores forståelse af PACT/PKR-akseregulering og lncRNAs rolle i stressresponser.
PACT indeholder tre separate domæner.Hver af de to første dsRBD'er er tilstrækkelig til at opnå høj affinitetsbinding af PACT til PKR, mens det tredje domæne (D3) er påkrævet til PKR-aktivering in vitro og in vivo.Vores undersøgelse viste, at DARS-AS1 fortrinsvis interagerer med D3-domænet (fig. 3h).I betragtning af den store størrelse af lncRNA'et (768 nukleotider) kan DARS-AS1-binding til D3 fysisk inhibere interaktionen mellem PACT-domænet af dsRBD og PKR og derved blokere associationen af ​​PACT og PKR.PACT-punktmutationer, der erstattede Ser246 og Ser287 i D3 med alanin eller aspartat, forstyrrede dets bindingsaffinitet for DARS-AS1, hvilket pegede på vigtigheden af ​​D3's overordnede strukturelle og elektriske egenskaber i deres sammenhæng.Yderligere detaljer om denne mekanisme vil være påkrævet i fremtiden ved at bruge mere præcis biokemisk analyse og højopløsnings-PACT-strukturanalyse.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at DARS-AS1 fremmer celleproliferation gennem flere mekanismer51,52,53.I et eksempel observerede efterforskere, at DARS-AS1 opregulerede dets antisense-protein-kodende DARS-gen ved at målrette mod miP-194-5p i nyrekræftceller.I denne undersøgelse havde DARS-AS1 knockdown ringe effekt på DARS-transkription i flere typer kræft, herunder i det mindste kolorektal-, bryst- og leverkræft.Fordi lncRNA'er udviser celle- og vævsspecifikke ekspressionsmønstre, bevares funktionelle mekanismer muligvis ikke på tværs af kræfttyper, hvilket kan bidrage til denne uoverensstemmelse mellem vores observationer og tidligere vurderinger af forskellige kræftformer.Særlige undersøgelser er nødvendige for at belyse de specifikke mekanismer af forskellige fysiologiske og patologiske processer.
En analyse af kliniske data viste, at DARS-AS1-ekspression i tumorer er omvendt korreleret med cancerpatienters overlevelse, hvilket understreger vigtigheden af ​​DARS-AS1/PACT/PKR-aksen i cancerprognose.Som konklusion viser vores undersøgelse, at DARS-AS1 er en regulator af PACT/PKR-signalaksen, fremmer kræftcelleproliferation og hæmmer apoptose under stressreaktionen, hvilket giver en anden forskningslinje og er af interesse for fremtidig forskning i potentielle behandlinger .
Humane cellelinjer SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 og HEK293T blev opnået fra National Cell Line Resource Infrastructure i Kina.Alle celler blev holdt i DMEM-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suppleret med 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) og 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ved 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (phosphor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normal muse-IgG, CST (5415S);normal kanin IgG, CST (2729S).Antistoffer blev fortyndet 1:1000 i PBST til Western blotting og 1:100 for IP.
sgRNA'er blev udviklet ved hjælp af et offentligt tilgængeligt værktøj kaldet CRISPR-ERA66.Vi brugte standardværktøjsparametrene til sgRNA-udvikling og algoritmen beregnede sgRNA-bindingssteder i 3 kb-regionen.centreret om TSS.Puljer af sgRNA-oligonukleotider blev syntetiseret hos CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) og klonet ind i humaniserede pgRNA-plasmider (Addgene #44248).I alt 12 µg puljet humaniseret pgRNA-plasmid, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) og 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) blev co-transficeret i 5 x 106 HEK293T-reagens i 106-transektionsskåle. celler (CWBIO, Beijing, Kina) efter producentens instruktioner.Virusholdige supernatanter blev opsamlet 48 og 72 timer efter transfektion og filtreret gennem et 0,45 µm filter.Til screening blev SW620-celler, der udtrykker dCas9/KRAB-fusionsproteinet, opnået ved virustransduktion.Modificerede SW620-celler blev inficeret med virusbiblioteket i fire uafhængige infektionsforsøg ved en MOI på 0,1-0,3 og blev udtaget med 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) i 2 dage.Derefter blev celler dyrket i 18 dage in vitro med en minimumsbiblioteksdækning på 500 celler/sgRNA til screening.
Genomisk DNA blev ekstraheret i overensstemmelse med instruktionerne fra QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Tyskland; 51183).I alt blev 100 μg genomisk DNA pr. biologisk gentagelse brugt til at opbygge biblioteket.sgRNA-regionen blev amplificeret ved to omgange PCR og bundet til en stregkode.
PCR-produkter blev oprenset ved hjælp af NucleoSpin®-gel og PCR-oprensningskit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland; 740609.250) og kvantificeret ved hjælp af Qubit™ HS dobbeltstrenget DNA-detektionskit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS-assayet blev brugt til at måle celleproliferation.Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en initial tæthed på 2000 celler/brønd.Det relative antal celler blev målt dagligt på det angivne tidspunkt i i alt 4-6 dage.For hver brønd blev 20 μl MTS-reagens (Promega) fortyndet med 100 μl DMEM, inkuberet med celler i 4 timer ved 37°C, og derefter blev OD490 målt.
Kapaciteten til uforankret vækst blev opdaget ved at analysere dannelsen af ​​kugler.Kort fortalt blev 2000 celler transficeret med shRNA DARS-AS1 eller kontrol shRNA dyrket i mikroplader med ultralav vedhæftning (Corning) med medium ændring hver 4. dag.Sfæroiderne blev talt efter 14 dage.500 celler transficeret med DARS-AS1-overekspressionsplasmidet eller et kontrolplasmid blev anvendt til forstærkningsassayet, ellers var metoden uændret.
RNA blev transskriberet under anvendelse af T7 RNA-polymerase og biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ifølge instruktionerne fra Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).De her anvendte primere er anført i supplerende tabel 4.
Proteinkodende PACT- eller PKR-regioner blev klonet ind i pET15b (Addgene #73619) og transformeret ind i BL21(DE3).Bakterierne blev inkuberet natten over i LB forsynet med ampicillin og derefter fortyndet 100 gange med frisk LB.Når OD600 af mediet nåede 0,8, blev 1 mM IPTG tilsat for at inducere proteinekspression.Efter inkubation natten over under forsigtig rystning (250 rpm ved 20°C) blev cellepelleten opsamlet ved centrifugering (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspender cellepelleten i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) og inkuber på is i 30 minutter, soniker derefter (15 min, 5 s on/off, på is) og centrifuger (13.000) rpm).30 min, 4°С).Supernatanten blev derefter påført Ni-NTA-harpiks (QIAGEN) 3 gange ved 4°C, vasket 4 gange med vaskebuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) og elueret 3 gange med i alt af 10 ml eluentbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCI, 300 mM imidazol).Oprenset protein blev bestemt under anvendelse af WB, og koncentrationen blev bestemt under anvendelse af Qubit™-proteinassay-kittet (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-assays blev udført som tidligere beskrevet med modifikationer.Kort fortalt lyser 1x RIP-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasin-ribonukleasehæmmer (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) cytostatisk 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) og centrifuger ved 13.000 rpm i 15 minutter ved 4 °C.Supernatanten blev derefter inkuberet med protein A+G magnetiske perler (Millipore) konjugeret med 5 μg anti-PACT antistof (Abeam) eller IgG (CST).Perlerne blev vasket 5 gange med 5x RIP-buffer og derefter fordøjet med proteinase K (NEB).RNA blev ekstraheret med Trizol og bestemt ved RT-qPCR.Primere er præsenteret i supplerende tabel 5.
In vitro RIP-assayet blev udført i overensstemmelse med en modificeret standard RIP-assayprotokol.I alt 5 pmol in vitro-transskriberet RNA blev fortyndet 1x med RIP-buffer og annealet ved inkubation ved 65°C i 5 minutter efterfulgt af langsom afkøling til stuetemperatur.I alt 5 pmol af intakte eller muterede flag-mærkede PACT-proteiner blev oprenset fra E. coli.Inkuber med renatureret RNA i 2 timer ved 4°C og følg ovenstående procedure for RIP-analyse for anti-flag IP.
Til RNA-udvidelsesanalyse blev 1x107 celler lyseret med 1xRIP buffer.Efter centrifugering ved 13.000 rpm i 15 minutter ved 4°C blev supernatanten forbehandlet med 30 μl streptavidin magnetiske perler (Beckman) i 2 timer ved 4°C.Det rensede lysat blev derefter forsynet med gær-tRNA og inkuberet med 40 pmol renatureret RNA natten over ved 4°C, derefter i yderligere 2 timer, og 20 μl nye streptavidin magnetiske perler blokeret med BSA blev tilsat.Vasketrinnet bestod af 4 gange med 5x RIP-buffer og 4 gange med 1x RIP-buffer.De tilsvarende proteiner blev elueret med biotin-elueringsbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) og adskilt på NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Efter sølvfarvning (Beyotime Biotechnology) blev visse bånd skåret ud og analyseret ved MS.
Co-IP-analyse blev udført for at teste interaktionen mellem PACT og PKR.Kort fortalt blev supernatantlysater fremstillet ved at inkubere 1 x 107 lyserede celler i 1 x RIP-buffer efterfulgt af centrifugering ved 13.000 rpm i 15 minutter ved 4°C.Lysater blev fyldt med protein A + G magnetiske perler, konjugeret med 5 µg anti-PACT antistof og forsigtigt roteret natten over ved 4°C.Perlerne blev vasket 3 gange med 5 x RIP buffer, to gange med 1 x RIP buffer og elueret med 1 x SDS buffer.Det genvundne protein blev analyseret med SDS-PAGE-gel og detekteret med WB.
To pmol mærket PACT og 1 pmol PKR blev oprenset fra E. coli.Fortynd i 1 x RIP-buffer og inkuber med 10 pmol renatureret RNA i 2 timer ved 4 °C.Derefter blev de inkuberet med protein A+G magnetisk perle-konjugeret anti-mærket antistof i yderligere to timer.Perlerne blev derefter vasket fire gange med 1 x RIP-buffer og elueret med 1 x SDS-buffer.Den resulterende PACT og PKR blev detekteret af WB.