Nyheder

Tak fordi du besøger Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Effektive fotosensibilisatorer er især vigtige for den udbredte kliniske anvendelse af fototerapi.Konventionelle fotosensibilisatorer lider imidlertid generelt af kortbølgelængdeabsorption, utilstrækkelig fotostabilitet, lavt kvanteudbytte af reaktive oxygenarter (ROS) og aggregeringsinduceret quenching af ROS.Her rapporterer vi en nær-infrarød (NIR) supramolekylær fotosensibilisator (RuDA) medieret af selvsamling af Ru(II)-aren organometalliske komplekser i vandig opløsning.RuDA kan kun generere singlet oxygen (1O2) i aggregeret tilstand, og det udviser åbenlys aggregeringsinduceret 1O2-genereringsadfærd på grund af en signifikant stigning i crossover-processen mellem singlet-triplet-systemet.Under påvirkning af 808 nm laserlys udviser RuDA et 1O2 kvanteudbytte på 16,4% (FDA-godkendt indocyaningrøn: ΦΔ=0,2%) og en høj fototermisk konverteringseffektivitet på 24,2% (kommercielle guld nanorods) med fremragende fotostabilitet.: 21,0 %, guld nanoskaller: 13,0 %).Derudover kan RuDA-NP'er med god biokompatibilitet fortrinsvis akkumulere på tumorsteder, hvilket forårsager signifikant tumorregression under fotodynamisk terapi med en 95,2% reduktion i tumorvolumen in vivo.Denne aggregeringsforstærkende fotodynamiske terapi giver en strategi til udvikling af fotosensibilisatorer med gunstige fotofysiske og fotokemiske egenskaber.
Sammenlignet med konventionel terapi er fotodynamisk terapi (PDT) en attraktiv behandling af kræft på grund af dens betydelige fordele såsom nøjagtig spatiotemporal kontrol, ikke-invasivitet, ubetydelig lægemiddelresistens og minimering af bivirkninger 1,2,3.Under lysbestråling kan de anvendte fotosensibilisatorer aktiveres til at danne stærkt reaktive oxygenarter (ROS), hvilket fører til apoptose/nekrose eller immunrespons4,5. De fleste konventionelle fotosensibilisatorer, såsom chloriner, porphyriner og anthraquinoner, har imidlertid relativt kort bølgelængdeabsorption (frekvens < 680 nm), hvilket resulterer i dårlig lysgennemtrængning på grund af den intense absorption af biologiske molekyler (f.eks. hæmoglobin og melanin) i den synlige region6,7. De fleste konventionelle fotosensibilisatorer, såsom chloriner, porphyriner og anthraquinoner, har imidlertid relativt kort bølgelængdeabsorption (frekvens < 680 nm), hvilket resulterer i dårlig lysgennemtrængning på grund af den intense absorption af biologiske molekyler (f.eks. hæmoglobin og melanin) i den synlige region6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. De fleste almindelige fotosensibilisatorer såsom chloriner, porphyriner og anthraquinoner har imidlertid relativt kort bølgelængdeabsorption (< 680 nm), hvilket resulterer i dårlig lysgennemtrængning på grund af intens absorption af biologiske molekyler (f.eks. hæmoglobin og melanin) i det synlige område6,7.然而 e导致光穿透性差.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差. Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. De fleste traditionelle fotosensibilisatorer såsom chloriner, porphyriner og anthraquinoner har imidlertid relativt kort bølgelængdeabsorption (frekvens < 680 nm) på grund af stærk absorption af biomolekyler såsom hæmoglobin og melanin, hvilket resulterer i dårlig lysgennemtrængning.Synligt område 6.7.Derfor er nær-infrarøde (NIR) absorberende fotosensibilisatorer, der aktiveres i det 700-900 nm "terapeutiske vindue", velegnede til fototerapi.Da nær-infrarødt lys absorberes mindst af biologiske væv, kan det føre til dybere penetration og mindre fotoskader8,9.
Desværre har eksisterende NIR-absorberende fotosensibilisatorer generelt dårlig fotostabilitet, lav singlet oxygen (1O2) genereringskapacitet og aggregeringsinduceret 1O2 quenching, hvilket begrænser deres kliniske anvendelse10,11.Selvom der er gjort en stor indsats for at forbedre de fotofysiske og fotokemiske egenskaber af konventionelle fotosensibilisatorer, har flere rapporter indtil videre rapporteret, at NIR-absorberende fotosensibilisatorer kan løse alle disse problemer.Derudover har flere fotosensibilisatorer vist lovende for effektiv generering af 1O212,13,14, når de bestråles med lys over 800 nm, da fotonenergien falder hurtigt i nær-IR-området.Triphenylamin (TFA) som en elektrondonor og [1,2,5]thiadiazol-[3,4-i]dipyrido[a,c]phenazin (TDP) som en elektronacceptorgruppe Donor-acceptor (DA) type farvestoffer en klasse af farvestoffer, absorberende nær-infrarød, som er blevet grundigt undersøgt til nær-infrarød bioimaging II og fototermisk terapi (PTT) på grund af deres smalle båndgab.Farvestoffer af DA-typen kan således anvendes til PDT med nær-IR-excitation, selvom de sjældent er blevet undersøgt som fotosensibilisatorer for PDT.
Det er velkendt, at den høje effektivitet af intersystem crossing (ISC) af fotosensibilisatorer fremmer dannelsen af ​​1O2.En fælles strategi til at fremme ISC-processen er at forbedre spin-orbit-koblingen (SOC) af fotosensibilisatorer ved at indføre tunge atomer eller specielle organiske dele.Denne tilgang har dog stadig nogle ulemper og begrænsninger19,20.For nylig har supramolekylær selvsamling givet en bottom-up intelligent tilgang til fremstilling af funktionelle materialer på molekylært niveau,21,22 med adskillige fordele inden for fototerapi: (1) selvsamlede fotosensibilisatorer kan have potentialet til at danne båndstrukturer.Svarende til elektroniske strukturer med en tættere fordeling af energiniveauer på grund af overlappende baner mellem byggesten.Derfor vil energitilpasningen mellem den lavere singlet-exciterede tilstand (S1) og den tilstødende triplet-exciterede tilstand (Tn) blive forbedret, hvilket er gavnligt for ISC-processen 23, 24 .(2) Supramolekylær samling vil reducere ikke-strålende afslapning baseret på den intramolekylære bevægelsesbegrænsningsmekanisme (RIM), som også fremmer ISC-processen 25, 26.(3) Den supramolekylære samling kan beskytte de indre molekyler af monomeren mod oxidation og nedbrydning og derved i høj grad forbedre fotosensibilisatorens fotostabilitet.I betragtning af ovenstående fordele mener vi, at supramolekylære fotosensibilisatorsystemer kan være et lovende alternativ til at overvinde manglerne ved PDT.
Ru(II)-baserede komplekser er en lovende medicinsk platform til potentielle anvendelser i diagnosticering og terapi af sygdomme på grund af deres unikke og attraktive biologiske egenskaber28,29,30,31,32,33,34.Derudover giver overfloden af ​​exciterede tilstande og de afstembare fotofysisk-kemiske egenskaber af Ru(II)-baserede komplekser store fordele for udviklingen af ​​Ru(II)-baserede fotosensibilisatorer35,36,37,38,39,40.Et bemærkelsesværdigt eksempel er ruthenium(II) polypyridylkomplekset TLD-1433, som i øjeblikket er i fase II kliniske forsøg som fotosensibilisator til behandling af ikke-muskelinvasiv blærekræft (NMIBC)41.Derudover er ruthenium(II)aren organometalliske komplekser i vid udstrækning brugt som kemoterapeutiske midler til cancerbehandling på grund af deres lave toksicitet og lette modifikation42,43,44,45.De ioniske egenskaber af Ru(II)-aren organometalliske komplekser kan ikke kun forbedre den dårlige opløselighed af DA-kromoforer i almindelige opløsningsmidler, men også forbedre samlingen af ​​DA-kromoforer.Derudover kan den pseudoctaedriske halvsandwichstruktur af de organometalliske komplekser af Ru(II)-arener sterisk forhindre H-aggregering af kromoforer af DA-type og derved lette dannelsen af ​​J-aggregering med rødforskudte absorptionsbånd.Imidlertid kan iboende ulemper ved Ru(II)-aren-komplekser, såsom lav stabilitet og/eller dårlig biotilgængelighed, påvirke den terapeutiske effektivitet og in vivo-aktivitet af aren-Ru(II)-komplekser.Imidlertid har undersøgelser vist, at disse ulemper kan overvindes ved at indkapsle rutheniumkomplekser med biokompatible polymerer ved fysisk indkapsling eller kovalent konjugation.
I dette arbejde rapporterer vi DA-konjugerede komplekser af Ru(II)-aren (RuDA) med en NIR-trigger via en koordinationsbinding mellem DAD-kromoforen og Ru(II)-aren-delen.De resulterende komplekser kan selv samles til metalosupramolekylære vesikler i vand på grund af ikke-kovalente interaktioner.Især gav den supramolekylære samling RuDA polymerisationsinducerede intersystem-overkrydsningsegenskaber, hvilket signifikant øgede ISC-effektiviteten, hvilket var meget gunstigt for PDT (fig. 1A).For at øge tumorakkumulering og in vivo biokompatibilitet blev FDA-godkendt Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) brugt til at indkapsle RuDA47,48,49 for at skabe RuDA-NP nanopartikler (figur 1B), der fungerede som en højeffektiv PDT/dual- tilstand PTT proxy.I kræftfototerapi (figur 1C) blev RuDA-NP brugt til at behandle nøgne mus med MDA-MB-231-tumorer for at studere effektiviteten af ​​PDT og PTT in vivo.
Skematisk illustration af den fotofysiske mekanisme af RuDA i monomere og aggregerede former til cancerfototerapi, syntese af B RuDA-NP'er og C RuDA-NP'er for NIR-aktiveret PDT og PTT.
RuDA, bestående af TPA- og TDP-funktionalitet, blev fremstillet i overensstemmelse med proceduren vist i Supplerende Figur 1 (Figur 2A), og RuDA blev karakteriseret ved 1H- og 13C NMR-spektre, elektrosprayioniseringsmassespektrometri og elementaranalyse (Supplerende figurer 2-4 ).RuDA elektrondensitetsforskelkortet for den laveste singletovergang blev beregnet af tidsafhængig tæthedsfunktionsteori (TD-DFT) for at studere ladningsoverførselsprocessen.Som vist i Supplerende figur 5, driver elektrondensiteten hovedsageligt fra triphenylamin til TDP-acceptorenheden efter fotoexcitation, hvilket kan tilskrives en typisk intramolekylær ladningsoverførsel (CT) overgang.
Kemisk struktur af malm B Absorptionsspektre af malm i blandinger af forskellige forhold mellem DMF og vand.C Normaliserede absorptionsværdier af RuDA (800 nm) og ICG (779 nm) versus tid ved 0,5 W cm-2 af 808 nm laserlys.D Fotonedbrydningen af ​​ABDA er angivet ved RuDA-induceret dannelse af 1O2 i DMF/H2O-blandinger med forskelligt vandindhold under påvirkning af laserstråling med en bølgelængde på 808 nm og en effekt på 0,5 W/cm2.
Abstrakt - UV-synlig absorptionsspektroskopi blev brugt til at studere malmens selvsamlingsegenskaber i blandinger af DMF og vand i forskellige forhold.Som vist i fig.2B udviser RuDA absorptionsbånd fra 600 til 900 nm i DMF med et maksimalt absorptionsbånd ved 729 nm.Forøgelse af mængden af ​​vand førte til et gradvist rødt skift af malmabsorptionsmaksimum til 800 nm, hvilket indikerer J-aggregering af malm i det samlede system.Fotoluminescensspektrene for RuDA i forskellige opløsningsmidler er vist i supplerende figur 6. RuDA ser ud til at udvise typisk NIR-II-luminescens med en maksimal emissionsbølgelængde på ca.1050 nm i henholdsvis CH2Cl2 og CH3OH.Det store Stokes-skift (ca. 300 nm) af RuDA indikerer en signifikant ændring i geometrien af ​​den exciterede tilstand og dannelsen af ​​lavenergi-exciterede tilstande.Luminescenskvanteudbyttet af malm i CH2Cl2 og CH3OH blev bestemt til at være henholdsvis 3,3 og 0,6%.I en blanding af methanol og vand (5/95, v/v) blev der dog observeret en lille rødforskydning af emissionen og et fald i kvanteudbyttet (0,22%), hvilket kan skyldes selvsamlingen af ​​Ore .
For at visualisere selvsamlingen af ​​ORE brugte vi flydende atomkraftmikroskopi (AFM) til at visualisere de morfologiske ændringer i ORE i methanolopløsning efter tilsætning af vand.Når vandindholdet var under 80 %, blev der ikke observeret nogen tydelig aggregering (Supplerende Fig. 7).Men med en yderligere stigning i vandindholdet til 90-95% opstod der små nanopartikler, hvilket indikerede selvsamlingen af ​​malm.Derudover påvirkede laserbestråling med en bølgelængde på 808 nm ikke absorptionsintensiteten af ​​RuDA i vandigt opløsning (fig. 2C og supplerende fig. 8).I modsætning hertil faldt absorbansen af ​​indocyaningrøn (ICG som kontrol) hurtigt ved 779 nm, hvilket indikerer fremragende fotostabilitet af RuDA.Derudover blev stabiliteten af ​​RuDA-NP'er i PBS (pH = 5,4, 7,4 og 9,0), 10% FBS og DMEM (høj glucose) undersøgt ved UV-synlig absorptionsspektroskopi på forskellige tidspunkter.Som vist i supplerende figur 9 blev der observeret små ændringer i RuDA-NP-absorptionsbånd i PBS ved pH 7,4/9,0, FBS og DMEM, hvilket indikerer fremragende stabilitet af RuDA-NP.I et surt medium (рН = 5,4) blev der imidlertid fundet hydrolyse af malm.Vi evaluerede også stabiliteten af ​​RuDA og RuDA-NP ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) metoder.Som vist i supplerende figur 10 var RuDA stabil i en blanding af methanol og vand (50/50, v/v) i den første time, og hydrolyse blev observeret efter 4 timer.Imidlertid blev kun en bred konkav-konveks top observeret for RuDA NP'er.Derfor blev gelpermeationskromatografi (GPC) brugt til at vurdere stabiliteten af ​​RuDA NP'er i PBS (pH = 7,4).Som vist i supplerende figur 11, efter 8 timers inkubation under de testede betingelser, ændrede tophøjden, topbredden og toparealet af NP RuDA sig ikke signifikant, hvilket indikerer fremragende stabilitet af NP RuDA.Derudover viste TEM-billeder, at morfologien af ​​RuDA-NP nanopartiklerne forblev praktisk talt uændret efter 24 timer i fortyndet PBS-buffer (pH = 7,4, Supplerende Fig. 12).
Fordi selvsamling kan give malm forskellige funktionelle og kemiske egenskaber, observerede vi frigivelsen af ​​9,10-anthracendiylbis(methylen)dimalonsyre (ABDA, indikator 1O2) i methanol-vand-blandinger.Malm med forskelligt vandindhold50.Som vist i figur 2D og supplerende figur 13 blev der ikke observeret nogen nedbrydning af ABDA, når vandindholdet var under 20 %.Med en stigning i luftfugtighed til 40 % skete der ABDA-nedbrydning, hvilket fremgår af et fald i intensiteten af ​​ABDA-fluorescens.Det er også blevet observeret, at højere vandindhold resulterer i hurtigere nedbrydning, hvilket tyder på, at RuDA-selvsamling er nødvendig og gavnlig for ABDA-nedbrydning.Dette fænomen er meget forskelligt fra moderne ACQ (aggregation-induced quenching) kromoforer.Ved bestråling med en laser med en bølgelængde på 808 nm er kvanteudbyttet af 1O2 RuDA i en blanding af 98 % H2O/2 % DMF 16,4 %, hvilket er 82 gange højere end ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, demonstrerer en bemærkelsesværdig generationseffektivitet 1O2 RuDA i tilstanden af ​​aggregering.
Elektronspin under anvendelse af 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinon (TEMP) og 5,5-dimethyl-1-pyrrolin N-oxid (DMPO) som spinfælder Resonansspektroskopi (ESR) blev brugt til at identificere de resulterende arter AFK.af RuDA.Som vist i Supplerende Figur 14 er det blevet bekræftet, at 1O2 genereres ved bestrålingstider mellem 0 og 4 minutter.Når RuDA blev inkuberet med DMPO under bestråling, blev der desuden påvist et typisk EPR-signal med fire linjer på 1:2:2:1 DMPO-OH·addukt, hvilket indikerer dannelsen af ​​hydroxylradikaler (OH·).Samlet set viser ovenstående resultater RuDAs evne til at stimulere ROS-produktion gennem en dobbelt type I/II fotosensibiliseringsproces.
For bedre at forstå de elektroniske egenskaber af RuDA i monomere og aggregerede former, blev grænsemolekylære orbitaler af RuDA i monomere og dimere former beregnet ved hjælp af DFT-metoden.Som vist i fig.3A er den højest besatte molekylære orbital (HOMO) af monomert RuDA delokaliseret langs ligandrygraden, og den laveste ubesatte molekylære orbital (LUMO) er centreret på TDP-acceptorenheden.Tværtimod er elektrontætheden i den dimere HOMO koncentreret på liganden af ​​et RuDA-molekyle, mens elektrondensiteten i LUMO hovedsageligt er koncentreret om acceptorenheden af ​​et andet RuDA-molekyle, hvilket indikerer, at RuDA er i dimeren.Funktioner af CT.
A HOMO og LUMO af malm beregnes i monomere og dimere former.B Singlet- og tripletenerginiveauer af malm i monomerer og dimerer.C Estimerede niveauer af RuDA og mulige ISC-kanaler som monomere C og dimere D. Pile angiver mulige ISC-kanaler.
Fordelingen af ​​elektroner og huller i de lavenergi-singlet-exciterede tilstande af RuDA i de monomere og dimere former blev analyseret ved hjælp af Multiwfn 3.852.53-softwaren, som blev beregnet ved hjælp af TD-DFT-metoden.Som angivet på den ekstra etiket.Som vist i figur 1-2 er monomere RDA-huller for det meste delokaliseret langs ligand-rygraden i disse singlet-exciterede tilstande, mens elektroner for det meste er placeret i TDP-gruppen, hvilket viser de intramolekylære karakteristika af CT.Derudover er der for disse singlet-exciterede tilstande mere eller mindre overlap mellem huller og elektroner, hvilket tyder på, at disse singlet-exciterede tilstande yder et vist bidrag fra lokal excitation (LE).For dimerer blev der ud over intramolekylære CT- og LE-træk observeret en vis andel af intermolekylære CT-træk i de respektive tilstande, især S3, S4, S7 og S8, baseret på intermolekylær CT-analyse, med CT intermolekylære overgange som de vigtigste. (Supplerende tabel).3).
For bedre at forstå de eksperimentelle resultater undersøgte vi yderligere egenskaberne af RuDA-exciterede tilstande for at udforske forskellene mellem monomerer og dimerer (Supplerende tabeller 4-5).Som vist i figur 3B er energiniveauerne af de singlet- og triplet-exciterede tilstande af dimeren meget tættere end monomerens, hvilket hjælper med at reducere energigabet mellem S1 og Tn. Det er blevet rapporteret, at ISC-overgangene kunne realiseres inden for et lille energigab (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellem S1 og Tn54. Det er blevet rapporteret, at ISC-overgangene kunne realiseres inden for et lille energigab (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellem S1 og Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-жn. ДES1-жn. Det er blevet rapporteret, at ISC-overgange kan realiseres inden for et lille energigab (ΔES1-Tn <0,3 eV) mellem S1 og Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔДES1,3Tn.4n.4n. Det er blevet rapporteret, at ISC-overgangen kan realiseres inden for et lille energigab (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellem S1 og Tn54.Derudover skal kun én orbital, optaget eller ubesat, afvige i bundne singlet- og triplettilstande for at give et SOC-integral, der ikke er nul.Baseret på analysen af ​​excitationsenergien og orbitalovergangen er alle mulige kanaler for ISC-overgangen således vist i fig.3C,D.Navnlig er kun én ISC-kanal tilgængelig i monomeren, mens den dimere form har fire ISC-kanaler, der kan forbedre ISC-overgangen.Derfor er det rimeligt at antage, at jo flere RuDA-molekyler der er aggregeret, jo mere tilgængelige vil ISC-kanalerne være.Derfor kan RuDA-aggregater danne to-bånds elektroniske strukturer i singlet- og triplettilstandene, hvilket reducerer energigabet mellem S1 og tilgængelig Tn, og derved øger effektiviteten af ​​ISC for at lette 1O2-generering.
For yderligere at belyse den underliggende mekanisme syntetiserede vi en referenceforbindelse af aren-Ru(II)-komplekset (RuET) ved at erstatte to ethylgrupper med to triphenylamin-phenylgrupper i RuDA (fig. 4A, for fuld karakterisering, se ESI, Supplerende 15) -21 ) Fra donor (diethylamin) til acceptor (TDF) har RuET de samme intramolekylære CT-karakteristika som RuDA.Som forventet viste absorptionsspektret af RuET i DMF et lavenergi-ladningsoverførselsbånd med stærk absorption i det nære infrarøde område i området 600-1100 nm (fig. 4B).Derudover blev RuET-aggregering også observeret med stigende vandindhold, hvilket blev afspejlet i rødforskydningen af ​​absorptionsmaksimum, hvilket yderligere blev bekræftet af flydende AFM-billeddannelse (Supplerende Fig. 22).Resultaterne viser, at RuET ligesom RuDA kan danne intramolekylære tilstande og samle sig selv til aggregerede strukturer.
Kemisk struktur af RuET.B Absorptionsspektre af RuET i blandinger af forskellige forhold mellem DMF og vand.Grunde C EIS Nyquist for RuDA og RuET.Fotostrømsvar D af RuDA og RuET under påvirkning af laserstråling med en bølgelængde på 808 nm.
Fotonedbrydningen af ​​ABDA i nærvær af RuET blev evalueret ved bestråling med en laser med en bølgelængde på 808 nm.Overraskende nok blev der ikke observeret nogen nedbrydning af ABDA i forskellige vandfraktioner (Supplerende Fig. 23).En mulig årsag er, at RuET ikke effektivt kan danne en båndet elektronisk struktur, fordi ethylkæden ikke fremmer effektiv intermolekylær ladningsoverførsel.Derfor blev elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS) og transient fotostrømmålinger udført for at sammenligne de fotoelektrokemiske egenskaber af RuDA og RuET.Ifølge Nyquist-plottet (Figur 4C) viser RuDA en meget mindre radius end RuET, hvilket betyder, at RuDA56 har hurtigere intermolekylær elektrontransport og bedre ledningsevne.Derudover er fotostrømtætheden af ​​RuDA meget højere end den for RuET (fig. 4D), hvilket bekræfter den bedre ladningsoverførselseffektivitet af RuDA57.Phenylgruppen af ​​triphenylamin i Ore spiller således en vigtig rolle i at tilvejebringe intermolekylær ladningsoverførsel og dannelse af en båndet elektronisk struktur.
For at øge tumorakkumulering og in vivo biokompatibilitet indkapslede vi RuDA yderligere med F127.Den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af RuDA-NP'er blev bestemt til at være 123,1 nm med en snæver fordeling (PDI = 0,089) ved anvendelse af den dynamiske lysspredningsmetode (DLS) (Figur 5A), som fremmede tumorakkumulering ved at øge permeabilitet og retention.EPR) effekt.TEM-billederne viste, at Ore NP'er har en ensartet sfærisk form med en gennemsnitlig diameter på 86 nm.Det bemærkes, at absorptionsmaksimumet for RuDA-NP'er optrådte ved 800 nm (Supplerende Fig. 24), hvilket indikerer, at RuDA-NP'er kan bevare funktionerne og egenskaberne af selvsamlende RuDA'er.Det beregnede ROS kvanteudbytte for NP Ore er 15,9%, hvilket er sammenligneligt med Ore. De fototermiske egenskaber af RuDA NP'er blev undersøgt under påvirkning af laserstråling med en bølgelængde på 808 nm ved hjælp af et infrarødt kamera.Som vist i fig.5B,C oplevede kontrolgruppen (kun PBS) en lille stigning i temperaturen, mens temperaturen af ​​RuDA-NPs-opløsningen steg hurtigt med stigende temperatur (ΔT) til 15,5, 26,1 og 43,0°C.Høje koncentrationer var henholdsvis 25, 50 og 100 µM, hvilket indikerer en stærk fototermisk effekt af RuDA NP'er.Derudover blev der taget målinger af opvarmnings-/afkølingscyklus for at evaluere den fototermiske stabilitet af RuDA-NP og sammenligne med ICG.Temperaturen af ​​Ore NP'er faldt ikke efter fem opvarmnings-/afkølingscyklusser (fig. 5D), hvilket indikerer den fremragende fototermiske stabilitet af Ore NP'er.I modsætning hertil udviser ICG lavere fototermisk stabilitet set fra den tilsyneladende forsvinden af ​​det fototermiske temperaturplateau under de samme betingelser.Ifølge den tidligere metode58 blev den fototermiske konverteringseffektivitet (PCE) af RuDA-NP beregnet til 24,2%, hvilket er højere end eksisterende fototermiske materialer såsom guld nanorods (21,0%) og guld nanoskaller (13,0%)59.Således udviser NP Malm fremragende fototermiske egenskaber, hvilket gør dem til lovende PTT-midler.
Analyse af DLS- og TEM-billeder af RuDA NP'er (indsat).B Termiske billeder af forskellige koncentrationer af RuDA NP'er udsat for laserstråling ved en bølgelængde på 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermiske konverteringskurver for forskellige koncentrationer af malm-NP'er, som er kvantitative data.B. D Temperaturstigning af ORE NP og ICG over 5 opvarmning-afkølingscyklusser.
Fotocytotoksicitet af RuDA NP'er mod MDA-MB-231 humane brystcancerceller blev evalueret in vitro.Som vist i fig.6A, B, RuDA-NP'er og RuDA udviste ubetydelig cytotoksicitet i fravær af bestråling, hvilket indebærer lavere mørk toksicitet af RuDA-NP'er og RuDA.Efter eksponering for laserstråling ved en bølgelængde på 808 nm viste RuDA- og RuDA-NP'er dog stærk fotocytotoksicitet mod MDA-MB-231-kræftceller med IC50-værdier (halvmaksimum hæmmende koncentration) på henholdsvis 5,4 og 9,4 μM, hvilket demonstrerer at RuDA-NP og RuDA har potentiale for kræftfototerapi.Derudover blev fotocytotoksiciteten af ​​RuDA-NP og RuDA yderligere undersøgt i tilstedeværelsen af ​​vitamin C (Vc), en ROS scavenger, for at belyse rollen af ​​ROS i lys-induceret cytotoksicitet.Det er klart, at cellelevedygtighed steg efter tilsætning af Vc, og IC50-værdierne for RuDA og RuDA NP'er var henholdsvis 25,7 og 40,0 μM, hvilket beviser den vigtige rolle, ROS spiller i fotocytotoksiciteten af ​​RuDA og RuDA NP'er.Lysinduceret cytotoksicitet af RuDA-NP'er og RuDA i MDA-MB-231 cancerceller ved farvning af levende/døde celler ved anvendelse af calcein AM (grøn fluorescens for levende celler) og propidiumiodid (PI, rød fluorescens for døde celler).bekræftet af celler) som fluorescerende prober.Som vist i figur 6C forblev celler behandlet med RuDA-NP eller RuDA levedygtige uden bestråling, som det fremgår af intens grøn fluorescens.Tværtimod blev der kun observeret rød fluorescens under laserbestråling, hvilket bekræfter den effektive fotocytotoksicitet af RuDA eller RuDA NP'er.Det er bemærkelsesværdigt, at grøn fluorescens optrådte ved tilsætning af Vc, hvilket indikerer en krænkelse af fotocytotoksiciteten af ​​RuDA og RuDA NP'er.Disse resultater stemmer overens med in vitro fotocytotoksicitetsassays.
Dosisafhængig levedygtighed af A RuDA- og B RuDA-NP-celler i MDA-MB-231-celler i henholdsvis nærvær eller fravær af Vc (0,5 mM).Fejlsøjler, middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.C Farvningsanalyse af levende/døde celler under anvendelse af calcein AM og propidiumiodid som fluorescerende prober.Målestok: 30 µm.Repræsentative billeder af tre biologiske gentagelser fra hver gruppe vises.D Konfokale fluorescensbilleder af ROS-produktion i MDA-MB-231-celler under forskellige behandlingsbetingelser.Grøn DCF-fluorescens indikerer tilstedeværelsen af ​​ROS.Bestråles med en laser med en bølgelængde på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).Målestok: 30 µm.Repræsentative billeder af tre biologiske gentagelser fra hver gruppe vises.E Flowcytometri RuDA-NP'er (50 µM) eller RuDA (50 µM) behandlingsanalyse med eller uden 808 nm laser (0,5 W cm-2) i nærvær og fravær af Vc (0,5 mM) i 10 min.Repræsentative billeder af tre biologiske gentagelser fra hver gruppe vises.F Nrf-2, HSP70 og HO-1 af MDA-MB-231-celler behandlet med RuDA-NP'er (50 µM) med eller uden 808 nm laserbestråling (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), celler udtrykker 2).Repræsentative billeder af to biologiske gentagelser fra hver gruppe vises.
Intracellulær ROS-produktion i MDA-MB-231-celler blev undersøgt under anvendelse af 2,7-dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-farvningsmetoden.Som vist i fig.6D udviste celler behandlet med RuDA-NP'er eller RuDA tydelig grøn fluorescens, når de blev bestrålet med 808 nm-laseren, hvilket indikerer, at RuDA-NP'er og RuDA har en effektiv evne til at generere ROS.Tværtimod blev der i fravær af lys eller i nærvær af Vc kun observeret et svagt fluorescerende signal fra cellerne, hvilket indikerede en let dannelse af ROS.Intracellulære ROS-niveauer i RuDA-NP-celler og RuDA-behandlede MDA-MB-231-celler blev yderligere bestemt ved flowcytometri.Som vist i supplerende figur 25 blev den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) genereret af RuDA-NP'er og RuDA under 808 nm laserbestråling signifikant forøget med henholdsvis ca. 5,1 og 4,8 gange sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket bekræfter deres fremragende dannelse af AFK.kapacitet.Imidlertid var intracellulære ROS-niveauer i RuDA-NP- eller MDA-MB-231-celler behandlet med RuDA kun sammenlignelige med kontroller uden laserbestråling eller i nærvær af Vc, svarende til resultaterne af konfokal fluorescensanalyse.
Det er blevet vist, at mitokondrier er hovedmålet for Ru(II)-aren-komplekser60.Derfor blev den subcellulære lokalisering af RuDA og RuDA-NP'er undersøgt.Som vist i supplerende figur 26 viser RuDA og RuDA-NP lignende cellulære distributionsprofiler med den højeste akkumulering i mitokondrier (henholdsvis 62,5 ± 4,3 og 60,4 ± 3,6 ng/mg protein).Imidlertid blev der kun fundet en lille mængde Ru i de nukleare fraktioner af Ore og NP Ore (henholdsvis 3,5 og 2,1%).Den resterende cellefraktion indeholdt resterende ruthenium: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg protein) for RuDA og 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg protein) for RuDA-NP'er.Generelt akkumuleres malm og NP malm hovedsageligt i mitokondrier.For at vurdere mitokondriel dysfunktion brugte vi JC-1 og MitoSOX Red-farvning til at vurdere henholdsvis mitokondriel membranpotentiale og superoxidproduktionskapacitet.Som vist i Supplerende Fig. 27 blev intens grøn (JC-1) og rød (MitoSOX Red) fluorescens observeret i celler behandlet med både RuDA og RuDA-NP'er under 808 nm laserbestråling, hvilket indikerer, at både RuDA og RuDA-NP'er meget fluorescerende Det kan effektivt inducere mitokondriel membrandepolarisering og superoxidproduktion.Desuden blev mekanismen for celledød bestemt ved hjælp af flowcytometri-baseret analyse af annexin V-FITC/propidiumiodid (PI).Som vist i figur 6E, når de blev bestrålet med 808 nm laser, inducerede RuDA og RuDA-NP en signifikant øget tidlig apoptosehastighed (nederste højre kvadrant) i MDA-MB-231-celler sammenlignet med PBS eller PBS plus laser.behandlede celler.Men når Vc blev tilføjet, faldt apoptosefrekvensen af ​​RuDA og RuDA-NP signifikant fra 50,9% og 52,0% til henholdsvis 15,8% og 17,8%, hvilket bekræfter den vigtige rolle af ROS i fotocytotoksiciteten af ​​RuDA og RuDA-NP..Derudover blev lette nekrotiske celler observeret i alle testede grupper (øverste venstre kvadrant), hvilket tyder på, at apoptose kan være den fremherskende form for celledød induceret af RuDA og RuDA-NP'er.
Da oxidativ stressskade er en væsentlig determinant for apoptose, blev den nukleare faktor forbundet med erythroid 2, faktor 2 (Nrf2) 62, en nøgleregulator af antioxidantsystemet, undersøgt i RuDA-NPs-behandlet MDA-MB-231.Virkningsmekanisme af RuDA NP'er induceret af bestråling.På samme tid blev ekspression af nedstrøms protein hæm oxygenase 1 (HO-1) også påvist.Som vist i figur 6F og supplerende figur 29 øgede RuDA-NP-medieret fototerapi Nrf2- og HO-1-ekspressionsniveauer sammenlignet med PBS-gruppen, hvilket indikerer, at RuDA-NP'er kan stimulere signalveje for oxidativ stress.For at studere den fototermiske effekt af RuDA-NPs63 blev ekspressionen af ​​varmechokproteinet Hsp70 også evalueret.Det er klart, at celler behandlet med RuDA-NP'er + 808 nm laserbestråling viste øget ekspression af Hsp70 sammenlignet med de to andre grupper, hvilket afspejler et cellulært respons på hypertermi.
De bemærkelsesværdige in vitro-resultater fik os til at undersøge in vivo-ydelsen af ​​RuDA-NP i nøgne mus med MDA-MB-231-tumorer.Vævsfordelingen af ​​RuDA NP'er blev undersøgt ved at bestemme indholdet af ruthenium i lever, hjerte, milt, nyrer, lunger og tumorer.Som vist i fig.7A viste det maksimale indhold af Ore NP'er i normale organer ved det første observationstidspunkt (4 timer), mens det maksimale indhold blev bestemt i tumorvæv 8 timer efter injektion, muligvis på grund af Ore NP'er.EPR-effekt af LF.Ifølge fordelingsresultaterne blev den optimale varighed af behandling med NP-malm taget 8 timer efter administration.For at illustrere processen med akkumulering af RuDA-NP'er i tumorsteder blev de fotoakustiske (PA) egenskaber af RuDA-NP'er overvåget ved at registrere PA-signalerne af RuDA-NP'er på forskellige tidspunkter efter injektion.Først blev PA-signalet af RuDA-NP in vivo vurderet ved at optage PA-billeder af et tumorsted efter intratumoral injektion af RuDA-NP.Som vist i Supplerende Figur 30 viste RuDA-NP'er et stærkt PA-signal, og der var en positiv korrelation mellem RuDA-NP-koncentration og PA-signalintensitet (Supplerende Figur 30A).Derefter blev in vivo PA-billeder af tumorsteder optaget efter intravenøs injektion af RuDA og RuDA-NP på forskellige tidspunkter efter injektion.Som vist i figur 7B steg PA-signalet af RuDA-NP'er fra tumorstedet gradvist med tiden og nåede et plateau 8 timer efter injektionen, i overensstemmelse med vævsfordelingsresultater bestemt ved ICP-MS-analyse.Med hensyn til RuDA (Supplerende Fig. 30B) forekom den maksimale PA-signalintensitet 4 timer efter injektion, hvilket indikerer en hurtig hastighed for indtrængen af ​​RuDA i tumoren.Derudover blev udskillelsesadfærden af ​​RuDA og RuDA-NP'er undersøgt ved at bestemme mængden af ​​ruthenium i urin og fæces ved hjælp af ICP-MS.Den vigtigste eliminationsvej for RuDA (Supplerende Fig. 31) og RuDA-NP'er (Fig. 7C) er via fæces, og effektiv clearance af RuDA og RuDA-NP'er blev observeret i løbet af den 8-dages undersøgelsesperiode, hvilket betyder, at RuDA og RuDA-NP'er kan effektivt elimineres fra kroppen uden langvarig toksicitet.
A. Ex vivo-fordeling af RuDA-NP i musevæv blev bestemt af Ru-indholdet (procentdel af administreret dosis af Ru (ID) pr. gram væv) på forskellige tidspunkter efter injektion.Data er middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.B PA-billeder af in vivo tumorsteder ved 808 nm excitation efter intravenøs administration af RuDA-NP'er (10 µmol kg-1) på forskellige tidspunkter.Efter intravenøs administration af RuDA NP'er (10 µmol kg-1) blev C Ru udskilt fra mus med urin og fæces med forskellige tidsintervaller.Data er middelværdi ± standardafvigelse (n = 3).
Opvarmningskapaciteten af ​​RuDA-NP in vivo blev undersøgt i nøgne mus med MDA-MB-231 og RuDA tumorer til sammenligning.Som vist i fig.8A og supplerende fig. 32 viste kontrolgruppen (saltvands) mindre temperaturændring (ΔT ≈ 3°C) efter 10 minutters kontinuerlig eksponering.Temperaturen af ​​RuDA-NP'er og RuDA steg dog hurtigt med maksimale temperaturer på henholdsvis 55,2 og 49,9 °C, hvilket gav tilstrækkelig hypertermi til in vivo cancerterapi.Den observerede stigning i høj temperatur for RuDA NP'er (ΔT ≈ 24°C) sammenlignet med RuDA (ΔT ≈ 19°C) kan skyldes dets bedre permeabilitet og akkumulering i tumorvæv på grund af EPR-effekten.
Infrarøde termiske billeder af mus med MDA-MB-231-tumorer bestrålet med 808 nm laser på forskellige tidspunkter 8 timer efter injektion.Repræsentative billeder af fire biologiske gentagelser fra hver gruppe vises.B Relativt tumorvolumen og C Gennemsnitlig tumormasse for forskellige grupper af mus under behandling.D Kurver af kropsvægte for forskellige grupper af mus.Bestråles med en laser med en bølgelængde på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).Fejlsøjler, middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparrede, tosidede t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparrede to-halede t-tests *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001. E H&E-farvningsbilleder af større organer og tumorer fra forskellige behandlingsgrupper, herunder saltvand, saltvand + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + Laser grupper. E H&E-farvningsbilleder af større organer og tumorer fra forskellige behandlingsgrupper, herunder saltvand, saltvand + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + Laser grupper. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E-farvningsbilleder af større organer og tumorer fra forskellige behandlingsgrupper, herunder saltvand, saltvand + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + Lasergrupper.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 肿瘤 肿瘤 肿瘤 包括 包括 包括 包括 盐 水 水 水 水 、 、 、 、 、 、 ruda 、 盐 包括 包括 包括 包括 包括来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E-farvning af større organer og tumorer fra forskellige behandlingsgrupper inklusive saltvand, saltvand + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + laser.Målestok: 60 µm.
Effekten af ​​fototerapi in vivo med RuDA og RuDA NP'er blev evalueret, hvor nøgne mus med MDA-MB-231 tumorer blev intravenøst ​​injiceret med RuDA eller RuDA NP'er i en enkelt dosis på 10,0 µmol kg-1 via halevenen, og derefter 8 timer efter injektion.laserbestråling med en bølgelængde på 808 nm.Som vist i figur 8B blev tumorvolumener signifikant forøget i saltvands- og lasergrupperne, hvilket indikerer, at saltvand eller laser 808-bestråling havde ringe effekt på tumorvækst.Som i saltvandsgruppen blev hurtig tumorvækst også observeret hos mus behandlet med RuDA-NP'er eller RuDA i fravær af laserbestråling, hvilket viser deres lave mørketoksicitet.I modsætning hertil inducerede både RuDA-NP- og RuDA-behandling efter laserbestråling signifikant tumorregression med tumorvolumenreduktioner på henholdsvis 95,2 % og 84,3 % sammenlignet med den saltvandsbehandlede gruppe, hvilket indikerer fremragende synergistisk PDT., medieret af RuDA/CHTV-effekten.– NP eller malm Sammenlignet med RuDA viste RuDA NP'er en bedre fototerapeutisk effekt, hvilket primært skyldtes EPR-effekten af ​​RuDA NP'er.Tumorvækstinhiberingsresultater blev yderligere vurderet ved tumorvægt udskåret på dag 15 af behandling (fig. 8C og supplerende fig. 33).Den gennemsnitlige tumormasse i RuDA-NP-behandlede mus og RuDA-behandlede mus var henholdsvis 0,08 og 0,27 g, hvilket var meget lettere end i kontrolgruppen (1,43 g).
Derudover blev kropsvægten af ​​mus registreret hver tredje dag for at studere den mørke toksicitet af RuDA-NP'er eller RuDA in vivo.Som vist i figur 8D blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i kropsvægt for alle behandlingsgrupper. Endvidere blev hæmatoxylin- og eosin- (H&E)-farvningen af ​​de vigtigste organer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) fra forskellige behandlingsgrupper udført. Desuden blev hæmatoxylin- og eosin- (H&E)-farvning af de vigtigste organer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) fra forskellige behandlingsgrupper udført. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, печени, печени, печени, печени, печени, печи Derudover blev der udført hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af større organer (hjerte, lever, milt, lunger og nyrer) fra forskellige behandlingsgrupper.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）亊夒缌脏）进眢缌 (HAN) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селечени, селечном) Derudover blev hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af større organer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) udført i forskellige behandlingsgrupper.Som vist i fig.8E viser H&E-farvningsbillederne af fem større organer fra RuDA-NP'erne og RuDA-grupperne ingen åbenlyse abnormiteter eller organskader. 8E viser H&E-farvningsbillederne af fem større organer fra RuDA-NP'erne og RuDA-grupperne ingen åbenlyse abnormiteter eller organskader.Som vist i fig.8E, изображения окрашивания H&E leverer основных органов из групп RuDA-NPs og RuDA не демонстрируют явных органовигов анималигов. 8E, H&E-farvningsbilleder af fem større organer fra RuDA-NP'er og RuDA-grupperne viser ingen åbenlyse organabnormiteter eller læsioner.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显像没有显的夺庂如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Hvordan er det med рисунке 8E? Som vist i figur 8E viste H&E-farvningsbilleder af de fem hovedorganer fra RuDA-NP'erne og RuDA-grupperne ingen åbenlyse abnormiteter eller organskade.Disse resultater viste, at hverken RuDA-NP eller RuDA viste tegn på toksicitet in vivo. Desuden viste H&E-farvningsbilleder af tumorer, at både RuDA + Laser og RuDA-NPs + Laser-grupperne kunne forårsage alvorlig cancercelleødelæggelse, hvilket viser den fremragende in vivo fototerapeutiske effektivitet af RuDA og RuDA-NPs. Desuden viste H&E-farvningsbilleder af tumorer, at både RuDA + Laser og RuDA-NPs + Laser-grupperne kunne forårsage alvorlig cancercelleødelæggelse, hvilket viser den fremragende in vivo fototerapeutiske effektivitet af RuDA og RuDA-NPs.Derudover viste hæmatoxylin-eosin-farvede tumorbilleder, at både RuDA+Laser- og RuDA-NPs+Laser-grupper kan inducere alvorlig ødelæggelse af cancerceller, hvilket viser den overlegne fototerapeutiske effektivitet af RuDA og RuDA-NPs in vivo.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NPs 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & E 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 细胞 ， ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 . . . .Derudover viste hæmatoxylin- og eosin-farvede tumorbilleder, at både RuDA+Laser- og RuDA-NPs+Laser-grupper resulterede i alvorlig ødelæggelse af kræftceller, hvilket viste overlegen fototerapeutisk effekt af RuDA og RuDA-NPs in vivo.
Som konklusion blev Ru(II)-aren (RuDA) organometallisk kompleks med DA-type ligander designet til at lette ISC-processen ved hjælp af aggregeringsmetoden.Syntetiseret RuDA kan selv samles gennem ikke-kovalente interaktioner for at danne RuDA-afledte supramolekylære systemer, og derved lette 1O2-dannelse og effektiv fototermisk omdannelse til lys-induceret cancerterapi.Det er bemærkelsesværdigt, at monomer RuDA ikke genererede 1O2 under laserbestråling ved 808 nm, men kunne generere en stor mængde 1O2 i den aggregerede tilstand, hvilket demonstrerer rationaliteten og effektiviteten af ​​vores design.Efterfølgende undersøgelser har vist, at den supramolekylære samling giver RuDA forbedrede fotofysiske og fotokemiske egenskaber, såsom rødforskydningsabsorption og fotoblegningsmodstand, som er yderst ønskelige til PDT- og PTT-behandling.Både in vitro og in vivo eksperimenter har vist, at RuDA NP'er med god biokompatibilitet og god akkumulering i tumoren udviser fremragende lysinduceret anticanceraktivitet ved laserbestråling ved en bølgelængde på 808 nm.Således vil RuDA NP'er som effektive bimodale supramolekylære PDT/PTW-reagenser berige sættet af fotosensibilisatorer aktiveret ved bølgelængder over 800 nm.Det konceptuelle design af det supramolekylære system giver en effektiv rute for NIR-aktiverede fotosensibilisatorer med fremragende fotosensibiliserende effekter.
Alle kemikalier og opløsningsmidler blev hentet fra kommercielle leverandører og brugt uden yderligere oprensning.RuCl3 blev købt fra Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-phenanthrolin-5,6-dion) og 4,7-bis[4-(N,N-diphenylamino)phenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzothiadiazol blev syntetiseret ifølge tidligere undersøgelser64,65.NMR-spektre blev optaget på et Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrometer ved Southeastern University Analytical Test Center under anvendelse af d6-DMSO eller CDCl3 som opløsningsmiddel.Kemiske skift δ er angivet i ppm.med hensyn til tetramethylsilan, og interaktionskonstanterne J er angivet i absolutte værdier i hertz.Højopløsningsmassespektrometri (HRMS) blev udført på et Agilent 6224 ESI/TOF MS-instrument.Grundstofanalyse af C, H og N blev udført på en Vario MICROCHNOS elementær analysator (Elementar).UV-synlige spektre blev målt på et Shimadzu UV3600 spektrofotometer.Fluorescensspektre blev optaget på et Shimadzu RF-6000 spektrofluorimeter.EPR-spektre blev optaget på et Bruker EMXmicro-6/1-instrument.Morfologien og strukturen af ​​de forberedte prøver blev undersøgt på FEI Tecnai G20 (TEM) og Bruker Icon (AFM) instrumenter, der arbejder ved en spænding på 200 kV.Dynamisk lysspredning (DLS) blev udført på en Nanobrook Omni analysator (Brookhaven).Fotoelektrokemiske egenskaber blev målt på en elektrokemisk opstilling (CHI-660, Kina).Fotoakustiske billeder blev taget ved hjælp af FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR-systemet.Konfokale billeder blev opnået ved hjælp af et Olympus FV3000 konfokalmikroskop.FACS-analyse blev udført på et BD Calibur flowcytometer.Højtydende væskekromatografi (HPLC)-eksperimenter blev udført på et Waters Alliance e2695-system under anvendelse af en 2489 UV/Vis-detektor.Gel Permeation Chromatography (GPC) tests blev optaget på et Thermo ULTIMATE 3000 instrument under anvendelse af en ERC RefratoMax520 brydningsindeksdetektor.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-phenanthrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-diphenylamino)phenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) og iseddikesyre (30 ml) blev omrørt ved tilbagesvalingskøleskab i 12 timer.Opløsningsmidlet blev derefter fjernet i vakuum under anvendelse af en rotationsfordamper.Den resulterende remanens blev oprenset ved flashsøjlekromatografi (silicagel, CH2Cl2:MeOH=20:1) for at opnå RuDA som et grønt pulver (udbytte: 877,5 mg, 80%).anus.Beregnet for C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Fundet: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, IH), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Syntese af 4,7-bis[4-(N,N-diethylamino)phenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazol (L2): L2 blev syntetiseret i to trin.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) blev tilsat til N,N-diethyl-4-(tributylstannyl)anilin (1,05 g, 2,4 mmol) og 4,7-dibrom-5,6-dinitroopløsning - 2, 1,3-benzothiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) i tør toluen (100 ml).Blandingen blev omrørt ved 100°C i 24 timer.Efter fjernelse af toluenen i vakuum blev det resulterende faste stof vasket med petroleumsether.Derefter blev en blanding af denne forbindelse (234,0 mg, 0,45 mmol) og jernpulver (0,30 g, 5,4 mmol) i eddikesyre (20 ml) omrørt ved 80°C i 4 timer.Reaktionsblandingen blev hældt i vand, og det resulterende brune faste stof blev opsamlet ved filtrering.Produktet blev oprenset to gange ved vakuumsublimering for at give et grønt faststof (126,2 mg, 57 % udbytte).anus.Beregnet for C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Fundet: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C NMR (150 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Forbindelser blev fremstillet og oprenset ved at følge procedurer svarende til RuDA.anus.Beregnet for C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Fundet: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 105.07.24.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.24.23.4.24.4.24.4.24.4.24.4.24.4.24.24.24.24.24.24.44.24.24.44, 84, 84, 84.44, 84, 84.4.24.24.24.24.24.24.24.23.24.23.24.44,, 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA blev opløst i MeOH/H2O (5/95, v/v) i en koncentration på 10 μM.Absorptionsspektret af RuDA blev målt hvert 5. minut på et Shimadzu UV-3600 spektrofotometer under bestråling med laserlys med en bølgelængde på 808 nm (0,5 W/cm2).ICG-spektrene blev optaget under de samme betingelser som standarden.
EPR-spektrene blev optaget på et Bruker EMXmicro-6/1 spektrometer med en mikrobølgeeffekt på 20 mW, et scanningsområde på 100 G og en feltmodulation på 1 G. 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidon (TEMP) og 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) blev brugt som spin-fælder.Elektronspinresonansspektre blev registreret for blandede opløsninger af RuDA (50 µM) og TEMF (20 mM) eller DMPO (20 mM) under påvirkning af laserstråling med en bølgelængde på 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT- og TD-DFT-beregninger for RuDA blev udført ved PBE1PBE/6-31 G*//LanL2DZ-niveauer i vandig opløsning ved hjælp af Gauss-programmet 1666,67,68.HOMO-LUMO-, hul- og elektronfordelingerne af den lavenergi-singlet exciterede tilstand RuDA blev plottet ved hjælp af GaussView-programmet (version 5.0).
Vi forsøgte først at måle genereringseffektiviteten af ​​1O2 RuDA ved hjælp af konventionel UV-synlig spektroskopi med ICG (ΦΔ = 0,002) som standard, men fotonedbrydningen af ​​ICG påvirkede resultaterne kraftigt.Kvanteudbyttet af 1O2 RuDA blev således målt ved at detektere en ændring i intensiteten af ​​ABDA-fluorescens ved ca. 428 nm, når det blev bestrålet med en laser med en bølgelængde på 808 nm (0,5 W/cm2).Eksperimenter blev udført på RuDA og RuDA NP'er (20 μM) i vand/DMF (98/2, v/v) indeholdende ABDA (50 μM).Kvanteudbyttet af 1O2 blev beregnet ved hjælp af følgende formel: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS og rICG er reaktionshastighederne for ABDA med 1O2 opnået fra henholdsvis fotosensibilisatoren og ICG.APS og AICG er absorbansen af ​​fotosensibilisatoren og ICG ved henholdsvis 808 nm.
AFM-målinger blev udført under flydende forhold ved anvendelse af scanningstilstanden på et Bruker Dimension Icon AFM-system.Under anvendelse af en åben struktur med flydende celler blev cellerne vasket to gange med ethanol og tørret med en strøm af nitrogen.Indsæt de tørrede celler i mikroskopets optiske hoved.Placer øjeblikkeligt en dråbe af prøven i væskepuljen og anbring den på cantileveren ved hjælp af en steril engangsplastiksprøjte og en steril nål.En anden dråbe placeres direkte på prøven, og når det optiske hoved sænkes, smelter de to dråber sammen og danner en menisk mellem prøven og væskereservoiret.AFM-målinger blev udført ved hjælp af en SCANASYST-FLUID V-formet nitridudkrager (Bruker, hårdhed k = 0,7 N m-1, f0 = 120-180 kHz).
HPLC-kromatogrammer blev opnået på et Waters e2695-system udstyret med en phoenix C18-søjle (250 x 4,6 mm, 5 µm) under anvendelse af en 2489 UV/Vis-detektor.Detektorens bølgelængde er 650 nm.Mobilfase A og B var henholdsvis vand og methanol, og den mobile fasestrømningshastighed var 1,0 ml·min-1.Gradienten (opløsningsmiddel B) var som følger: 100 % fra 0 til 4 minutter, 100 % til 50 % fra 5 til 30 minutter og nulstillet til 100 % fra 31 til 40 minutter.Malm blev opløst i en blandet opløsning af methanol og vand (50/50, efter volumen) i en koncentration på 50 μM.Injektionsvolumenet var 20 μl.
GPC-assays blev optaget på et Thermo ULTIMATE 3000-instrument udstyret med to PL aquagel-OH MIXED-H-søjler (2×300×7,5 mm, 8 µm) og en ERC RefratoMax520 brydningsindeksdetektor.GPC-søjlen blev elueret med vand ved en strømningshastighed på 1 ml/min ved 30°C.Malm-NP'er blev opløst i PBS-opløsning (pH = 7,4, 50 μM), injektionsvolumen var 20 μL.
Fotostrømme blev målt på en elektrokemisk opstilling (CHI-660B, Kina).De optoelektroniske responser, når laseren blev tændt og slukket (808 nm, 0,5 W/cm2) blev målt ved en spænding på 0,5 V i henholdsvis en sort boks.En standard tre-elektrode celle blev brugt med en L-formet glasagtig carbon elektrode (GCE) som en arbejdselektrode, en standard calomel elektrode (SCE) som en reference elektrode og en platin skive som en modelektrode.En 0,1 M Na2S04-opløsning blev anvendt som en elektrolyt.
Den humane brystcancercellelinje MDA-MB-231 blev købt fra KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kina, katalognummer: KG033).Celler blev dyrket i monolag i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, høj glucose) suppleret med en opløsning af 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 μg/ml) og streptomycin (100 μg/ml).Alle celler blev dyrket ved 37°C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
MTT-assayet blev brugt til at bestemme cytotoksiciteten af ​​RuDA og RuDA-NP'er i nærvær og fravær af lysbestråling, med eller uden Vc (0,5 mM).MDA-MB-231 cancerceller blev dyrket i plader med 96 brønde ved en celletæthed på ca. 1 x 105 celler/ml/brønd og inkuberet i 12 timer ved 37,0°C i en atmosfære af 5% CO2 og 95% luft.RuDA og RuDA NP'er opløst i vand blev tilsat til cellerne.Efter 12 timers inkubation blev cellerne udsat for 0,5 W cm-2 laserstråling ved en bølgelængde på 808 nm i 10 minutter (300 J cm-2) og derefter inkuberet i mørke i 24 timer.Cellerne blev derefter inkuberet med MTT (5 mg/ml) i yderligere 5 timer.Skift til sidst mediet til DMSO (200 µl) for at opløse de resulterende lilla formazankrystaller.OD-værdier blev målt ved hjælp af en mikropladelæser med en bølgelængde på 570/630 nm.IC50-værdien for hver prøve blev beregnet ved hjælp af SPSS-softwaren ud fra dosis-responskurver opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter.
MDA-MB-231-celler blev behandlet med RuDA og RuDA-NP i en koncentration på 50 μM.Efter 12 timers inkubation blev cellerne bestrålet med en laser med en bølgelængde på 808 nm og en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).I vitamin C (Vc)-gruppen blev celler behandlet med 0,5 mM Vc før laserbestråling.Celler blev derefter inkuberet i mørke i yderligere 24 timer, derefter farvet med calcein AM og propidiumiodid (20 μg/ml, 5 μl) i 30 minutter, derefter vasket med PBS (10 μl, pH 7,4).billeder af farvede celler.