Nyheder

Tak fordi du besøger Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Enzymatiske nærhedsmærkningsmetoder baseret på aktiverede estere eller phenoxyradikaler bruges i vid udstrækning til at kortlægge subcellulære proteomer og proteininteraktorer i levende celler.Aktiverede estere er imidlertid mindre reaktive, hvilket resulterer i en bred mærkningsradius, og phenoxyradikaler genereret ved peroxidbehandling kan interferere med redoxveje.Her rapporterer vi en nærhedsmærkningsafhængig fotoaktiveringsmetode (PDPL) udviklet ved genetisk at forbinde miniSOG fotosensibilisatorproteinet til et protein af interesse.Udløst af blåt lys og styret af eksponeringstid genereres singlet oxygen, og derefter opnås spatiotemporalt opløst mærkning af histidinrester af anilinproben.Vi demonstrerer dens høje kvalitet gennem organelspecifik proteomkortlægning.En side-by-side sammenligning af PDPL med TurboID viser en mere specifik og omfattende proteomisk dækning af PDPL.Dernæst anvendte vi PDPL på den sygdomsassocierede transkriptionelle coactivator BRD4 og E3 Parkin ligase og fandt tidligere ukendte interaktorer.Ved overekspressionsscreening blev to ukendte substrater, Ssu72 og SNW1, identificeret for Parkin, hvis nedbrydning medieres af ubiquitination-proteasom-vejen.
Nøjagtig karakterisering af proteinnetværk ligger til grund for mange fundamentale cellulære processer.Derfor vil meget nøjagtig spatiotemporal kortlægning af proteininteraktioner give et molekylært grundlag for at dechifrere biologiske veje, sygdomspatologi og forstyrre disse interaktioner til terapeutiske formål.Til dette formål er fremgangsmåder, der er i stand til at detektere tidsmæssige interaktioner i levende celler eller væv, yderst ønskelige.Affinitetsoprensningsmassespektrometri (AP-MS) er historisk blevet brugt til at identificere bindingspartnere for proteiner af interesse (POI'er).Med udviklingen af ​​kvantitative proteomiske metoder blev Bioplex3.0 skabt, den største database af proteinnetværk baseret på AP-MS.Selvom AP-MS er meget kraftfuldt, er cellelyse- og fortyndingstrinene i arbejdsgangen forspændt mod svage og forbigående bindingsinteraktioner og introducerer post-lysis-artefakter, såsom falske interaktionspar, der mangler kompartmentalisering før lysis.
For at løse disse problemer er der udviklet unaturlige aminosyrer (UAA) med tværbindingsgrupper og enzymatisk nærliggende mærkningsplatforme (f.eks. APEX og BioID)5.Selvom UAA-metoden er blevet anvendt med succes i mange scenarier og giver information om direkte proteinklæbemidler, er optimering af UAA-indsættelsesstedet stadig påkrævet.Endnu vigtigere er det en støkiometrisk mærkningsmetode, der mangler en katalytisk vending af mærkningsbegivenheder.I modsætning hertil fusionerer enzymatiske PL-metoder, såsom BioID-metoden, den konstruerede biotinligase til POI7, som efterfølgende aktiverer biotin for at danne et reaktivt biotinyl-AMP-estermellemprodukt.Enzymet katalyserer og frigiver således en aktiveret biotin "sky", der mærker proksimale lysinrester.BioID kræver dog mere end 12 timer for at opnå et tilstrækkeligt mærket signal, hvilket udelukker dets anvendelse med tidsmæssig opløsning.Ved at bruge rettet evolution baseret på gærvisning, blev TurboID designet baseret på BioID for at være mere effektiv, hvilket muliggør effektiv mærkning med biotin inden for 10 minutter, hvilket gør det muligt at studere mere dynamiske processer.Fordi TurboID er meget aktivt, og endogene biotinniveauer er tilstrækkelige til mærkning på lavt niveau, bliver baggrundsmærkning et potentielt problem, når stærkt forbedret og tidsbestemt mærkning er påkrævet ved tilsætning af eksogent biotin.Derudover er aktiverede estere dårligt reaktive (t1/2 ~5 min), hvilket kan føre til en stor mærkningsradius, især efter mætning af naboproteiner med biotin 5. I en anden tilgang er genetisk fusion af manipuleret ascorbatperoxidase (dvs. biotin- phenolradikaler og tillader proteinmærkning inden for et minut9, 10. APEX bruges i vid udstrækning til at identificere subcellulære proteomer, membranproteinkomplekser og cytosoliske signalproteinkomplekser 11, 12. Behovet for høje koncentrationer af peroxider kan imidlertid påvirke redoxproteiner eller -veje og forstyrre cellulære processer.
En ny metode, der er i stand til at generere mere reaktive mærkede radius-undertrykkelsesarter med høj rumlig og tidsmæssig nøjagtighed uden væsentligt at forstyrre cellulære veje, vil være en vigtig tilføjelse til eksisterende metoder. Blandt de reaktive arter vakte singlet oxygen vores opmærksomhed på grund af dets korte levetid og begrænsede diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Blandt de reaktive arter vakte singlet oxygen vores opmærksomhed på grund af dets korte levetid og begrænsede diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Blandt de aktive former tiltrak singlet ilt vores opmærksomhed på grund af dets korte levetid og begrænsede diffusionsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2伕瀄嚑伕跳ﺬ伕〷sﺬ伕〷 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Blandt aktive former tiltrækker singlet ilt vores opmærksomhed på grund af dets korte levetid og begrænsede diffusionsradius (t1/2 < 0,6 μs i celler).Singlet oxygen er blevet rapporteret til tilfældigt at oxidere methionin, tyrosin, histidin og tryptophan, hvilket gør det polært 14,15 til binding til amin- eller thiolbaserede prober16,17.Selvom singlet oxygen er blevet brugt til at mærke subcellulært kompartment-RNA, forbliver strategier til genbrug af endogene POI-nærhedsmarkører uudforskede.Her præsenterer vi en platform kaldet photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), hvor vi bruger blåt lys til at belyse POI'er fusioneret med en miniSOG fotosensibilisator og udløse singlet oxygengenerering for at oxidere proksimale rester, efterfulgt af aminholdige modifikationer til at oxidere kemiske prober til mellemliggende levende celler..Vi testede en gruppe kemiske prober for at maksimere tag-specificitet og identificerede modifikationssteder ved hjælp af en åben proteomics-workflow.En side-by-side sammenligning af PDPL med TurboID viser en mere specifik og omfattende proteomisk dækning af PDPL.Vi anvendte denne tilgang til organelspecifikke markører for det subcellulære proteom og generel proteomidentifikation af bindingspartnere for det cancerassocierede epigenetiske regulatoriske protein BRD4 og den Parkinsons sygdomsassocierede E3-ligase Parkin, som bekræftede både et kendt og et ukendt netværk af protein interaktioner..PDPL's evne til at genkende E3-substrater i store proteinkomplekser repræsenterer en situation, hvor genkendelse af indirekte bindemidler er påkrævet.To ukendte parkin-substrater medieret af ubiquitination-proteasom er blevet bekræftet in situ.
Fotodynamisk terapi (PDT)19 og kromofor-assisteret laserinaktivering (CALI)20, hvor lysbestråling med fotosensibilisatorer genererer singlet oxygen, kan inaktivere målproteiner eller forårsage celledød.Da singlet oxygen er et meget reaktivt stof med en teoretisk diffusionsafstand på omkring 70 nm, kan rumligt begrænset oxidation omkring fotosensibilisatoren kontrolleres.Baseret på dette koncept besluttede vi at bruge singlet oxygen til at opnå tæt mærkning af proteinkomplekser i levende celler.Vi har udviklet en PDPL kemoproteomisk tilgang til at opfylde fire funktioner: (1) at katalysere dannelsen af ​​aktivt singlet oxygen svarende til den PL enzymatiske tilgang;(2) tilvejebringe tidsbestemt mærkning ved lysinitiering;(3) ved ændring (4) Undgå at bruge endogene cofaktorer (såsom biotin) til at reducere baggrunden, eller brug stærkt forstyrrende eksogene reagenser (såsom peroxider) for at minimere celleeksponering for miljøstress.
Fotosensibilisatorer kan opdeles i to kategorier, herunder fluoroforer med lille molekylvægt (f.eks. rose bengal, methylenblåt)22 og genetisk kodede små proteiner (f.eks. miniSOG, KillerRed)23.For at opnå et modulært design udviklede vi den første generation af PDPL-platform ved at tilføje fotosensibiliserende (PS)-proteiner til POI24,25 (figur 1a).Når det bestråles med blåt lys, oxiderer singlet oxygen proksimale nukleofile aminosyrerester, hvilket resulterer i en umpolung polaritet, der er elektrofil og yderligere kan reagere med aminprobe nukleofiler16,17.Sonden er designet med et alkynhåndtag for at tillade klikkemi og træk ned for LC/MS/MS karakterisering.
Skematisk illustration af mærkning af proteinkomplekser medieret af miniSOG.Når de udsættes for blåt lys, genererer celler, der udtrykker miniSOG-POI, singlet oxygen, som modificerer interagerende proteiner, men ikke ikke-bindende proteiner.Mellemprodukter af fotooxidation opfanges af relæmærker af den kemiske aminprobe for at danne kovalente addukter.Alkynylgruppen på kemiproben tillader klikkemi til berigelse ved pull-down efterfulgt af LC-MS/MS kvantificering.b Kemisk struktur af aminprober 1-4.c Repræsentativ fluorescerende gelanalyse af mitokondrielle lokaliserede miniSOG-medierede proteomiske markører ved brug af prober 1-4 og relativ kvantificering baseret på gel densitometri.Signal-til-baggrundsforholdet af kemiske prober blev vurderet ved hjælp af negative kontroleksperimenter, der ekskluderede blåt lys, eller ved at bruge HEK293T-celler uden miniSOG-ekspression.n = 2 biologisk uafhængige prøver.Hver prik repræsenterer en biologisk replika.d Repræsentativ påvisning og kvantificering af PDPL ved hjælp af optimeret probe 3 i nærvær eller fravær af de angivne PDPL-komponenter som c.n = 3 biologisk uafhængige prøver.Hver prik repræsenterer en biologisk replika.Centerlinjer og whiskers repræsenterer middelværdien og ± standardafvigelsen.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokal billeddannelse af singlet oxygen med langt rød Si-DMA-farvning.Målestok: 10 µm.Gel billeddannelse og konfokale eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange med lignende resultater.
Vi testede først evnen af ​​de modne fotosensibilisatorer miniSOG26 og KillerRed23, stabilt udtrykt i HEK293T, til at mediere propargylaminmærkning af proteomet som en kemisk probe (Supplerende Fig. 1a).Gelfluorescensanalyse viste, at mærkning af hele proteomer blev opnået ved hjælp af miniSOG og blåt lysbestråling, mens der ikke blev observeret noget synligt mærkningsprodukt med KillerRed.For at forbedre signal-til-baggrund-forholdet testede vi derefter et sæt kemiske prober indeholdende anilin (1 og 3), propylamin (2) eller benzylamin (4).Vi observerede, at HEK293T-celler selv havde et højere baggrundssignal sammenlignet med intet blåt lys, muligvis på grund af den endogene riboflavin-fotosensibilisator, flavinmononukleotid (FMN) 27 . Anilin-baserede kemiske prober 1 og 3 gav bedre specificitet, hvor HEK293T stabilt udtrykte miniSOG i mitokondrier, der viste en >8 gange stigning i signalet for probe 3, mens probe 2 brugt i RNA-mærkningsmetoden CAP-seq kun viste ~2,5- fold signalstigning, sandsynligvis på grund af forskellige reaktivitetspræferencer mellem RNA og protein (fig. 1b, c). Anilin-baserede kemiske prober 1 og 3 gav bedre specificitet, hvor HEK293T stabilt udtrykte miniSOG i mitokondrier, der viste en >8 gange stigning i signalet for probe 3, mens probe 2 brugt i RNA-mærkningsmetoden CAP-seq kun viste ~2,5- fold signalstigning, sandsynligvis på grund af forskellige reaktivitetspræferencer mellem RNA og protein (fig. 1b, c).Anilin-baserede kemiske prober 1 og 3 viste bedre specificitet: HEK293T, som stabilt udtrykker miniSOG i mitokondrier, viser mere end en 8-fold stigning i signalet for probe 3, mens probe 2, brugt i CAP-seq RNA-mærkningsmetoden, kun viser ~2,5-fold signalstigning, sandsynligvis på grund af forskellige reaktivitetspræferencer mellem RNA og protein (fig. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilin-baserede kemiske prober 1 og 3 havde bedre specificitet, HEK293T udtrykte stabilt miniSOG i mitokondrier, og probe 3 havde over 8 gange stigning i signal, mens probe 2 til CAP-seq RNA-mærkningsmetoden kun viste ~2,5 gange stigning.i signalet, sandsynligvis på grund af forskellige reaktionspræferencer mellem RNA og protein (fig. 1b, c).Derudover blev probe 3-isomerer og hydrazinprober (prober 5, 6, 7) testet, hvilket bekræfter optimeringen af ​​probe 3 (Supplerende Fig. 1b, c).Tilsvarende afslørede in-gel fluorescensanalyse andre optimerede eksperimentelle parametre: bestrålingsbølgelængde (460 nm), kemisk probekoncentration (1 mM) og bestrålingstid (20 min) (Supplerende Fig. 2a-c).Udeladelse af en hvilken som helst komponent eller trin i PDPL-protokollen resulterede i signifikant signalvending til baggrunden (fig. Id).Især proteinmærkning blev signifikant reduceret i nærvær af natriumazid eller trolox, som er kendt for at slukke singlet oxygen.Tilstedeværelsen af ​​D2O, som er kendt for at stabilisere singlet oxygen, forstærker mærkningssignalet.For at undersøge bidraget fra andre reaktive oxygenarter til mærkning, blev mannitol og C-vitamin tilsat for at etablere henholdsvis hydroxyl- og superoxidradikalopfangere, 18, 29, men de viste sig ikke at reducere mærkning.Tilsætning af H2O2, men ikke belysning, resulterede ikke i mærkning (Supplerende Fig. 3a).Fluorescens-singlet oxygen-billeddannelse med Si-DMA-prober bekræftede tilstedeværelsen af ​​singlet-oxygen i HEK293T-miniSOG-ledningen, men ikke i den originale HEK293T-ledning.Derudover kunne mitoSOX Red ikke detektere superoxidproduktion efter belysning (fig. 1e og supplerende fig. 3b) 30. Disse data tyder kraftigt på, at singlet oxygen er den vigtigste reaktive oxygenart, der er ansvarlig for efterfølgende proteomisk mærkning.Cytotoksicitet af PDPL blev vurderet inklusive blåt lysbestråling og kemiske prober, og der blev ikke observeret nogen signifikant cytotoksicitet (Supplerende Fig. 4a).
For at studere mærkningsmekanismen og muliggøre proteomisk identifikation af proteinkomplekser ved hjælp af LC-MS/MS, skal vi først bestemme, hvilke aminosyrer der er modificeret og delta-massen af ​​probemærker.Methionin, histidin, tryptofan og tyrosin er blevet rapporteret at blive modificeret af singlet oxygen14,15.Vi integrerer TOP-ABPP31-workflowet med den objektive åbne søgning leveret af FragPipe-computerplatformen baseret på MSFragger32.Efter singlet oxygenmodifikation og kemisk probemærkning blev klikkemi udført under anvendelse af et biotinreduktionsmærke indeholdende en spaltelig linker efterfulgt af neutravidinstrækning og trypsinfordøjelse.Det modificerede peptid, der stadig var bundet til harpiksen, blev fotospaltet til LC-MS/MS-analyse (figur 2a og supplerende data 1).Et stort antal modifikationer forekom i hele proteomet med over 50 peptidkort (PSM)-matches anført (fig. 2b).Overraskende observerede vi kun modifikation af histidin, sandsynligvis på grund af den højere reaktivitet af oxideret histidin over for anilinprober end andre aminosyrer.Ifølge den offentliggjorte mekanisme for histidinoxidation med singlet oxygen,21,33 svarer den foreslåede delta-massestruktur på +229 Da til adduktet af probe 3 med 2-oxo-histidin efter to oxidationer, mens +247 Da er hydrolyseproduktet på +229 Da (Supplerende Fig. 5).Evalueringen af ​​MS2-spektret viste en høj pålidelighed af identifikation af de fleste af y- og b-ionerne, herunder identifikation af modificerede fragmentioner (y og b) (fig. 2c).Kontekstanalyse af den lokale sekvens af PDPL-modificerede histidiner afslørede en moderat motivpræference for små hydrofobe rester ved ±1 positioner (Supplerende Fig. 4b).I gennemsnit blev 1,4 histidiner identificeret pr. protein, og stederne for disse markører blev bestemt ved opløsningsmiddeltilgængeligt overfladeareal (SASA) og relativ opløsningsmiddeltilgængelighed (RSA)-analyse (Supplerende Fig. 4c,d).
En uvildig arbejdsgang til undersøgelse af resterende selektivitet ved hjælp af FragPipe-computerplatformen drevet af MSFragger.Spaltelige linkere anvendes i Click-kemi for at tillade fotospaltning af modificerede peptider fra streptavidinharpiks.En åben søgning blev iværksat for at identificere adskillige modifikationer samt relevante rester.b Tildel massen af ​​modifikationer, der forekommer i hele proteomet.Peptidkortlægning PSM.c MS2 spektral annotering af histidinsteder modificeret med probe 3. Som et repræsentativt eksempel tilføjede en kovalent reaktion med probe 3 +229,0938 Da til den modificerede aminosyre.d Mutationsassay bruges til at teste for PDPL-markører.PRDX3 (H155A, H225A) og PRDX1 (H10A, H81A, H169A) blev transficeret med vildtypeplasmider til anti-Flag-detektion.e Det syntetiske peptid blev omsat med oprenset miniSOG i nærvær af probe 3, og de tilsvarende produkter med Δm +247 og +229 blev noteret i LC-MS-spektret.f In vitro protein-til-protein-interaktioner modelleret med miniSOG-6xHis-tag og anti-6xHis-antistof.Antibiotin (streptavidin-HRP) og anti-mus Western blot-analyse af miniSOG-6xHis/anti-6xHis antistofkomplekser mærket med probe 3, afhængigt af tidspunktet for eksponering for lys.Mærkninger for individuelle proteiner er udtrykt i den tilsvarende molekylvægt: LC antistof let kæde, HC antistof tung kæde.Disse eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange med lignende resultater.
Til biokemisk verifikation af mærkningsstedet blev PRDX3 og PRDX1 identificeret ved massespektrometri ændret fra histidin til alanin og sammenlignet med vildtype i transfektionsassays.PDPL-resultaterne viste, at mutationen signifikant reducerede mærkning (fig. 2d).I mellemtiden blev peptidsekvenserne identificeret i den åbne søgning syntetiseret og reageret in vitro med oprenset miniSOG i nærvær af probe 3 og blåt lys, hvilket gav produkter med en masseforskydning på +247 og +229 Da, når de blev påvist ved LC-MS (fig. 2e).).For at teste, om interagerende proksimale proteiner kunne mærkes in vitro som reaktion på miniSOG-fotoaktivering, designede vi et kunstigt nærhedsassay ved interaktion mellem miniSOG-6xHis-proteinet og et anti-His monoklonalt antistof in vitro (figur 2f).I dette assay forventede vi proksimal mærkning af antistofs tunge og lette kæder med miniSOG.Faktisk viste anti-mus (genkendte de tunge og lette kæder af anti-6xHis-mærket antistof) og streptavidin Western blots stærk biotinylering af de tunge og lette kæder.Vi bemærkede især miniSOG-autobiotinylering på grund af 6xHis-mærket og tværbindinger mellem lette og tunge kæder, som kan være relateret til det tidligere beskrevne hul mellem lysin og 2-oxo-histidin proksimale respons.Som konklusion konkluderer vi, at PDPL modificerer histidin på en nærhedsafhængig måde.
Vores næste mål var at karakterisere det subcellulære proteom for at teste specificiteten af ​​in situ-mærkning.Derfor udtrykte vi stabilt miniSOG i kernen, mitokondriel matrix eller ydre ER-membran af HEK293T-celler (fig. 3a).Gelfluorescensanalyse afslørede rigelige mærkede bånd på tre subcellulære steder såvel som forskellige mærkningsmønstre (fig. 3b).Fluorescensbilleddannelsesanalyse viste høj specificitet af PDPL (fig. 3c).PDPL-arbejdsgangen blev efterfulgt af klikreaktioner med rhodaminfarvestoffer for at afgrænse subcellulære proteomer ved hjælp af fluorescensmikroskopi, og PDPL-signaler blev kolokaliseret med DAPI, mitokondrielle trackere eller ER-trackere, hvilket bekræfter PDPL's høje kvalitet.For de tre organelplaceringer viste en side-by-side sammenligning af PDPL med TurboID ved anvendelse af avidin western blot, at PDPL var mærket mere specifikt sammenlignet med deres respektive kontroller.Under PDPL-betingelser fremkom flere mærkede bånd, hvilket indikerer flere PDPL-mærkede proteiner (Supplerende Fig. 6a-d).
en skematisk repræsentation af miniSOG-medieret organelspecifik proteommærkning.miniSOG målretter mitokondriematrixen via fusion til de N-terminale 23 aminosyrer af human COX4 (mito-miniSOG), kernen via fusion til H2B (nucleus-miniSOG) og Sec61β via den cytoplasmatiske side af ER-membranen (ER-miniSOG) ).Indikationer omfatter gel-billeddannelse, konfokal billeddannelse og massespektrometri.b Repræsentative gelbilleder af tre organelspecifikke PDPL-profiler.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Repræsentative konfokale billeder af HEK293T-celler, der stabilt udtrykker miniSOG med forskellige subcellulære lokaliseringer påvist af antistof mærket V5 (rød).Subcellulære markører bruges til mitokondrier og ER (grøn).PDPL-arbejdsgangen inkluderer påvisning af miniSOG (gul) mærkede subcellulære proteomer ved hjælp af Cy3-azid-klikkemi.Målestok: 10 µm.d Vulkaniske plots af PDPL-mærkede proteomer i forskellige organeller kvantificeret ved umærket kvantificering (n = 3 uafhængige biologiske eksperimenter).Two-tailed Student's t-test blev brugt på vulkanplot.HEK293T vildtype blev brugt som en negativ kontrol. Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange ionintensitetsforskel). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange ionintensitetsforskel). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange forskel i ionintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og > 2 gange forskel i ionstyrke).Beslægtede proteiner, der er vigtige for HEK293T-miniSOG, men ikke vigtige for HEK293T, er vist med grønt.e Analyse af specificiteten af ​​proteomiske datasæt fra eksperimenter d.Det samlede antal statistisk signifikante proteiner i hver organel (røde og grønne prikker) er markeret øverst.Histogrammer viser proteiner lokaliseret i organeller baseret på MitoCarta 3.0, GO-analyse og A. Ting et al.mennesker.Separate datasæt for mitokondrier, kerner og ER.Disse eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange med lignende resultater.Rådata leveres i form af rådatafiler.
Opmuntret af gel- og billeddannelsesresultaterne blev mærkefri kvantificering brugt til at kvantificere det identificerede proteom i hver organel (Supplerende data 2).Utransficeret HEK293T blev brugt som en negativ kontrol til at trække baggrundsmarkører fra. Vulkanplotanalyse viste signifikant berigede proteiner (p < 0,05 og >2 gange ionintensitet) såvel som singletonproteiner, der kun er til stede i miniSOG-udtrykkende linjer (fig. 3d røde og grønne prikker). Vulkanplotanalyse viste signifikant berigede proteiner (p < 0,05 og >2 gange ionintensitet) såvel som singletonproteiner, der kun er til stede i miniSOG-udtrykkende linjer (fig. 3d røde og grønne prikker). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkanplotanalyse viste signifikant berigede proteiner (p<0,05 og >2 gange ionintensitet) såvel som enkelte proteiner, der kun er til stede i miniSOG-udtrykkende linjer (fig. 3d, røde og grønne prikker).火山图 分析 显示 出 显着 富集.火山图 分析 显示 出 显着 的. Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkanplotanalyse afslørede signifikant berigede proteiner (p<0,05 og >2x ionstyrke) såvel som enkelte proteiner, der kun er til stede i miniSOG-ekspressionslinjen (røde og grønne prikker i fig. 3d).Ved at kombinere disse data identificerede vi henholdsvis 1364, 461 og 911 statistisk signifikante nukleare, mitokondrielle og ER ydre membranproteiner.For at analysere nøjagtigheden af ​​organel-lokaliseret PDPL brugte vi MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analyse og A. Ting et al.et datasæt8 blev brugt for mitokondrier, kerne og ER til at teste organelspecificiteten af ​​de påviste proteiner, svarende til en nøjagtighed på 73,4, 78,5 og 73,0% (fig. 3e).Specificiteten af ​​PDPL bekræfter, at PDPL er et ideelt værktøj til at identificere organel-specifikke proteomer.Navnlig viste submitokondriel analyse af identificerede mitokondrielle proteiner, at det fangede proteom hovedsageligt var fordelt i matrixen og den indre membran (henholdsvis 226 og 106), og tegnede sig for 91,7% (362) af det samlede antal identificerede mitokondrielle proteiner.et højt niveau af PDPL blev yderligere bekræftet (Supplerende Fig. 7a).Tilsvarende viste subnuklear analyse, at det indfangede proteom hovedsageligt var fordelt i kernen, nukleoplasmaet og nukleolen (Supplerende Fig. 7b).Nuklear proteomisk analyse med et nuklear lokaliseringssignalpeptid (3xNLS) viste nøjagtighed svarende til H2B-konstruktionen (Supplerende Fig. 7c-h).For at bestemme specificiteten af ​​PDPL-markøren blev nuklear laminin A valgt som en mere diskret lokaliseret POI7-fælde.PDPL identificerede 36 signifikant berigede proteiner, hvoraf 12 proteiner (30,0% inklusive lamin A) var velkarakteriserede lamin A-interagerende proteiner annoteret af String-databasen, med en højere procentdel end BioID-metoden (122 proteiner) 28 af 28. , 22.9 %) 7. Vores metode identificerede færre proteiner, muligvis på grund af begrænsede mærkningsområder, hvilket blev muliggjort af mere aktiv singlet oxygen.GO-analyse viste, at de identificerede proteiner hovedsageligt var lokaliseret i nukleoplasmaet (26), nuklear membran (10), nuklear membran (9) og nuklear porer (5).Tilsammen udgjorde disse nuklear-lokaliserede proteiner 80% af de berigede proteiner, hvilket yderligere demonstrerer specificiteten af ​​PDPL (Supplerende Fig. 8a-d).
Efter at have etableret PDPL's evne til at udføre nærhedsmærkning i organeller, testede vi derefter, om PDPL kunne bruges til at analysere POI-bindingspartnere.Især søgte vi at definere PDPL-analyse af cytosoliske proteiner, som betragtes som mere vanskelige mål end deres membranlokaliserede modstykker på grund af deres meget dynamiske natur.Det bromodæne og ekstraterminale (BET) protein BRD4 har tiltrukket vores opmærksomhed for dets nøglerolle i forskellige sygdomme 35, 36 .Komplekset dannet af BRD4 er en transkriptionel coaktivator og et vigtigt terapeutisk mål.Ved at regulere ekspressionen af ​​c-myc og Wnt5a transkriptionsfaktorer menes BRD4 at være en nøgledeterminant for akut myeloid leukæmi (AML), multipelt myelom, Burkitts lymfom, tyktarmskræft og inflammatoriske sygdomme37,38.Derudover målretter nogle vira BRD4 for at regulere viral og cellulær transkription, såsom papillomavirus, HIV og SARS-CoV-236,39.
For at kortlægge BRD4-interaktionen ved hjælp af PDPL kombinerede vi miniSOG med en kort N- eller C-terminal isoform af BRD4.Proteomiske resultater afslørede en høj grad af overlap mellem de to konstruktioner (Supplerende Fig. 9a).Det nukleare proteom identificeret med miniSOG-H2B dækker 77,6 % af proteinerne, der interagerer med BRD4 (Supplerende Fig. 9b).Derefter blev forskellige tidspunkter for belysning (2, 5, 10, 20 min) brugt til at justere markørradius (fig. 4a og supplerende data 3).Vi konkluderer, at ved kortere fotoperioder vil PDPL primært mærke direkte bindingspartnere, mens længere perioder vil omfatte proteiner identificeret under kortere fotoaktiveringsperioder såvel som indirekte mål i mærkningskomplekser.Faktisk fandt vi stærkt overlap mellem tilstødende tidspunkter (84,6 % i 2 og 5 min; 87,7 % i 5 og 10 min; 98,7 % i 10 og 20 min) (fig. 4b og supplerende fig. 9c).I alle eksperimentelle grupper fandt vi ikke kun BRD4-selvmærkning, men flere kendte mål såsom MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A og HMGB1 annoteret i strengdatabasen.Ionstyrken af ​​disse mål er proportional med eksponeringstiden (fig. 4c og supplerende fig. 9d).GO-analyse af proteinerne identificeret i 2-minutters gruppen viste, at de identificerede proteiner var lokaliseret i kernen og var involveret i kromatin-ombygning og RNA-polymerasefunktion.Proteinets molekylære funktion blev beriget med kromatinbinding eller transkriptionel koaktivering, i overensstemmelse med BRD4-funktion (fig. 4d).Strengedatabaseaktiveret proteininteraktionsanalyse afslørede et første niveau af indirekte interaktioner mellem BRD4- og HDAC-familieinteragerende komplekser såsom SIN3A, NCOR2, BCOR og SAP130 (Fig. 4e og Supplerende Fig. 9e), i overensstemmelse med BRD4- og HDAC-bindende acetylerede histoner ..Derudover blev repræsentative mål identificeret af LC-MS/MS, herunder Sin3A, NSUN2, Fus og SFPQ, bekræftet ved Western blotting (fig. 4f).For nylig er den korte isoform af BRD4 blevet rapporteret at danne kerner med væske-væskefaseseparation (LLPS) egenskaber.De RNA-bindende proteiner Fus og SFPQ medierer LLPS af forskellige cellulære processer og er her blevet identificeret som uregistrerede BRD4-bindende proteiner.Interaktionen mellem BRD4 og SFPQ blev bekræftet af co-immunopræcipitation (co-IP) eksperimenter (figur 4g), hvilket tyder på en anden mekanisme for BRD4-medieret væske-væskefaseseparation, der fortjener yderligere undersøgelse.Tilsammen tyder disse resultater på, at PDPL er en ideel platform til at identificere kendte BRD4-interagerende såvel som ukendte bindingsproteiner.
en skematisk repræsentation af miniSOG-medieret BRD4 nærhedsmarkering, eksponeringstider: 2, 5, 10 og 20 min.b Overlapning af proteiner identificeret ved forskellige belysningstidspunkter.Proteinberigelse identificeret i HEK293T-miniSOG-BRD4 var statistisk signifikant sammenlignet med vildtype HEK293T.c Ionintensitet ved kvantificering af umærkede repræsentative kendte BRD4-bindende proteiner under den specificerede eksponeringstid.n = 3 biologisk uafhængige prøver.Data præsenteres som middel ± standardafvigelse.d Genontologisk analyse (GO) af proteiner identificeret i 2-minutters gruppen.De første ti GO-udtryk er angivet.Bobler er farvet i henhold til GO-termkategorien, og boblestørrelsen er proportional med antallet af proteiner, der findes i hvert udtryk.e Strenganalyse af proteiner, der interagerer med BRD4.De gule cirkler er direkte lim og de grå cirkler er det første lag indirekte lim.De røde linjer repræsenterer de eksperimentelt bestemte interaktioner, og de blå linjer repræsenterer de forudsagte interaktioner.f Repræsentative BRD4-bindingsmål identificeret i LC-MS/MS blev verificeret ved Western blotting.g Co-immunpræcipitationseksperimenter bekræfter interaktionen mellem SFPQ og BRD4.Disse eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange med lignende resultater.Rådata leveres i form af rådatafiler.
Ud over at identificere uregistrerede POI-associerede mål, antager vi, at PDPL vil være egnet til at identificere substrater for enzymer, hvilket ville kræve karakterisering af indirekte bindende proteiner i store komplekser for at annotere uregistrerede substrater.Parkin (kodet af PARK2) er en E3-ligase, og mutationer i parkin er kendt for at forårsage autosomal recessiv juvenil Parkinsons sygdom (AR-JP)42.Derudover er parkin blevet beskrevet som afgørende for mitofagi (mitokondriel autofagi) og fjernelse af reaktive iltarter.Men selvom flere parkin-substrater er blevet identificeret, er parkins rolle i denne sygdom stadig uklar.For at annotere dets ukarakteriserede substrater blev PDPL testet ved at tilføje miniSOG til N- eller C-terminalen af ​​parkin.Celler blev behandlet med carbonylcyanid-protontransportøren m-chlorphenylhydrazon (CCCP) for at aktivere parkin via PINK1-Parkin-vejen.Sammenlignet med vores BRD4 PDPL-resultater afslørede parkin N-terminus-fusion et større sæt målproteiner, selvom det dækkede en større del af C-terminus (177 ud af 210) (figur 5a, b og supplerende data 4).resultatet stemmer overens med rapporter om, at N-terminal tags kan afvigende aktivere Parkin44.Overraskende nok var der kun 18 overlappende proteiner i vores data med offentliggjorte AP-MS-resultater for Parkin43, sandsynligvis på grund af forskelle mellem cellelinjer og proteomics-arbejdsgange.Ud over fire kendte proteiner (ARDM1, HSPA8, PSMD14 og PSMC3) identificeret ved to metoder (fig. 5c)43.For yderligere at validere resultaterne af LC-MS/MS blev PDPL-behandling og efterfølgende Western blotting brugt til at sammenligne resultaterne af HEK293T-modercelleassayet og den stabile N-terminale parkinlinje.Tidligere ukendte mål CDK2, DUT, CTBP1 og PSMC4 blev testet med en kendt binder, DNAJB1 (fig. 5d).
Vulkanplot af parkin-interagerende proteiner i HEK293T-celler med stabilt udtrykt miniSOG fusioneret til N- eller C-terminalen af ​​parkin (n = 3 uafhængige biologiske eksperimenter).Two-tailed Student's t-test blev brugt på vulkanplot.HEK293T blev brugt som en negativ kontrol. Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange ionintensitetsforskel). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange ionintensitetsforskel). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og >2 gange forskel i ionintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant ændrede proteiner er fremhævet med rødt (p < 0,05 og > 2 gange forskel i ionstyrke).Beslægtede proteiner, der er vigtige for HEK293T-miniSOG, men ikke vigtige for HEK293T, er vist med grønt.b Venn-diagram, der viser overlappende proteiner mellem N-terminale og C-terminale konstruktioner.N-terminale tags kan afvigende aktivere parkin og resultere i mere genkendelige proteiner.c Venn-diagram, der viser overlappende proteiner mellem PDPL og AP-MS.Kendte interaktorer er opført, herunder 4 af 18 overlappende proteiner og 11 af 159 proteiner, der er specifikt identificeret i PDPL.d Repræsentative mål identificeret ved LC-MS/MS blev verificeret ved Western blotting.e Ssu72 og SNW1 blev identificeret som uregistrerede parkin-substrater.Disse FLAG-mærkede proteinplasmider blev transficeret ind i HEK293T og HEK293T-Parkin-miniSOG efterfulgt af CCCP-behandling på forskellige tidspunkter.Nedbrydningen var mere udtalt i Parkin-overekspressionslinjen.f Ved at bruge proteasomhæmmeren MG132 blev det bekræftet, at nedbrydningsprocessen af ​​Ssu72 og SNW1 medieres af proteasom-ubiquitinering.Disse eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange med lignende resultater.Rådata leveres i form af rådatafiler.
Især skal proteinerne identificeret af PDPL omfatte parkin-bindende proteiner og deres substrater.For at detektere uregistrerede parkinsubstrater valgte vi syv identificerede proteiner (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 og SNW1) og transficerede plasmider for at udsætte disse gener for normal HEK293T og stabilt udtrykke miniSOG-Parkin's efterfulgt af HEK293T.Niveauerne af Ssu72- og SNW1-proteiner blev signifikant reduceret i den stabile miniSOG-Parkin-linje (fig. 5e).Behandling med CCCP i 12 timer resulterede i den mest signifikante nedbrydning af begge substrater.For at undersøge om nedbrydningen af ​​Ssu72 og SNW1 er reguleret af proteasom-ubiquitinering, blev proteasomhæmmeren MG132 tilsat for at hæmme proteasomaktiviteten, og faktisk fandt vi ud af, at deres nedbrydningsproces blev hæmmet (fig. 5f).Yderligere ikke-substratmål blev bekræftet som Parkin-interaktorer under anvendelse af Western blotting (Supplerende Fig. 10), som viste konsistente resultater med LC-MS/MS.Som konklusion tillader integrationen af ​​PDPL-arbejdsgangen med målproteintransfektionsverifikation identifikation af uregistrerede E3-ligasesubstrater.
Vi har udviklet en fælles nærhedsmarkeringsplatform, der giver dig mulighed for at identificere interagerende POI'er i rum og tid.Platformen er baseret på miniSOG-fotosensibilisatorproteinet, som kun er omkring 12 kDa, mindre end halvdelen af ​​størrelsen af ​​det modne APEX2-enzym (27 kDa) og en tredjedel af størrelsen af ​​TurboID (35 kDa).Den mindre størrelse skulle i høj grad udvide rækkevidden af ​​applikationer til at studere små proteininteraktomer.Yderligere udforskning af yderligere fotosensibilisatorer, uanset om det er genetisk kodede proteiner eller små molekyler, er nødvendig for at øge kvanteudbyttet af singlet oxygen og udvide følsomheden af ​​denne tilgang.For den nuværende version af miniSOG kan høj tidsmæssig opløsning opnås ved hjælp af blå belysning for at aktivere nærhedsmarkører.Derudover frigav længere eksponeringstid en større "sky" af singlet oxygen, hvilket resulterede i modifikation af mere distale histidinrester, øget mærkningsradius og evnen til at finjustere den rumlige PDPL-opløsning.Vi testede også syv kemiske prober for at øge signal-til-baggrundsforholdet og undersøgte den molekylære mekanisme bag denne tilgang.TOP-ABPP-arbejdsgangen kombineret med upartisk åben søgning bekræftede, at modifikationer kun forekom i histidiner, og der blev ikke observeret noget konsistent mikromiljø for øgede histidinmodifikationer, bortset fra en moderat præference for histidiner i loop-regionen.
PDPL er også blevet brugt til at karakterisere subcellulære proteomer med proteomspecificitet og dækning, der mindst kan sammenlignes med andre nærhedsmærkning og organelspecifikke kemiske probemetoder.Nærhedsmarkører er også blevet brugt med succes til at karakterisere overflade-, lysosomale og sekretom-associerede proteomer46,47.Vi mener, at PDPL vil være kompatibel med disse subcellulære organeller.Derudover udfordrede vi PDPL ved at identificere mål for cytosolisk proteinbinding, der er mere komplekse end membranbundne proteiner på grund af deres dynamiske egenskaber og involvering i mere tidsmæssige interaktioner.PDPL blev påført to proteiner, den transkriptionelle coaktivator BRD4 og den sygdomsassocierede ligase E3 Parkin.Disse to proteiner blev valgt ikke kun for deres grundlæggende biologiske funktioner, men også for deres kliniske relevans og terapeutiske potentiale.For disse to POI'er blev kendte bindingspartnere såvel som uregistrerede mål identificeret.Især blev det faseadskillelsesassocierede protein SFPQ bekræftet af co-IP, hvilket kan indikere en ny mekanisme, hvorved BRD4 (kort isoform) regulerer LLPS.Samtidig mener vi, at identifikation af Parkin-substrater er et scenarie, hvor identifikation af indirekte klæbemidler er påkrævet.Vi identificerede to uidentificerede parkin-substrater og bekræftede deres nedbrydning langs ubiquitinerings-proteasom-vejen.For nylig er en mekanisme-baseret fangststrategi blevet udviklet til at detektere hydrolasesubstrater ved at fange dem med enzymer.Selvom dette er en meget kraftfuld metode, er den ikke egnet til analyse af substrater involveret i dannelsen af ​​store komplekser og kræver dannelse af kovalente bindinger mellem enzymet og substratet.Vi forventer, at PDPL kan udvides til at studere andre proteinkomplekser og enzymfamilier, såsom deubiquitinase- og metalloprotease-familierne.
En ny form for miniSOG, kaldet SOPP3, er blevet udviklet med forbedret singlet-iltproduktion.Vi sammenlignede miniSOG med SOPP3 og fandt forbedret mærkningsydelse, selvom signal-til-støj-forholdet forblev uændret (Supplerende Fig. 11).Vi antog, at optimering af SOPP3 (f.eks. gennem rettet evolution) ville føre til mere effektive fotosensibiliserende proteiner, der kræver kortere lystider og dermed tillader mere dynamiske cellulære processer at blive fanget.Især er den nuværende version af PDPL begrænset til det cellulære miljø, da det kræver blåt lys og ikke kan trænge ind i dybe væv.Denne funktion udelukker dens brug i dyremodelundersøgelser.Kombinationen af ​​optogenetik med PDPL kunne dog give mulighed for dyreforskning, især i hjernen.Derudover fjerner andre konstruerede infrarøde fotosensibilisatorer også denne begrænsning.Forskning er i øjeblikket i gang på dette område.
HEK293T-cellelinjen blev opnået fra ATCC (CRL-3216).Cellelinjen testede negativ for mycoplasmainfektion og blev dyrket i DMEM (Thermo, #C11995500BT) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Vistech, #SE100-B) og 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).vokset ind.
3-Aminophenylen (prøve 3) og (4-ethynylphenyl)methanamin (prøve 4) blev købt fra Bidepharm.Propylamin (probe 2) blev købt fra Energy-chemicals.N-(2-aminophenyl)pent-4-ynamid (probe 1) blev syntetiseret ifølge publicerede metoder.
Supplerende tabel 1 viser de genetiske konstruktioner, der er brugt i denne undersøgelse.MiniSOG- og KillerRed-sekvenserne blev klonet fra et gaveplasmid fra P. Zou (Peking University).Den mitokondrielle matrix-målretningssekvens blev afledt af de 23 N-terminale aminosyrer af COX4 og klonet ind i de angivne vektorer ved anvendelse af en Gibson-samling (Beyotime, #D7010S).For at målrette membranen og kernen af ​​det endoplasmatiske reticulum, SEC61B humant DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificeret ved PCR fra et cDNA-bibliotek af HEK293T-celler og H2B DNA (doneret af D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) og klonet, som nævnt ovenfor.Medmindre andet er angivet, blev andre proteingener anvendt til transfektion og konstruktion af stabile cellelinjer PCR-amplificeret fra HEK293T-celle-cDNA-biblioteket.G3S (GGGS) og G4S (GGGGS) blev brugt som linkere mellem lokkemadproteinet og miniSOG.Et V5-epitopmærke (GKPIPNPLLGLDST) blev tilføjet til disse fusionskonstruktioner.Til ekspression i pattedyr og for at etablere en stabil cellelinje blev miniSOG-fusionskonstruktionen subklonet ind i den pLX304 lentivirale vektor.Til bakteriel ekspression blev miniSOG klonet ind i pET21a-vektoren mærket 6xHis ved C-terminalen.
HEK293T-celler blev podet med 2,0 x 105 celler pr. brønd i plader med seks brønde og transficeret 24 timer senere med rekombinante lentivirale plasmider (2,4 μg pLX304) og virale pakningsplasmider (1,5 μg psPAX2 og 1,2 μg psPAX2 og 1,2 μg med pMD020yo. , #C0533), omkring 80 % fusion.Efter transfektion natten over blev mediet udskiftet og inkuberet i yderligere 24 timer.Indsamlingen af ​​virussen blev udført efter 24, 48 og 72 timer.Før infektion af målcellelinjerne blev det virale medium filtreret gennem et 0,8 μm filter (Merck, #millex-GP) og polybren (Solarbio, #H8761) blev tilsat til en koncentration på 8 μg/ml.Efter 24 timer fik cellerne lov til at komme sig ved at udskifte mediet.Celler blev udvalgt ved hjælp af 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) til de første tre passager som en lavere stringent selektion.Brug derefter 20 μg/ml som en mere stringent kur til de næste tre passager.
Celler blev podet i 12-brøndskamre (Ibidi, #81201) ved en tæthed på ca. 20.000 celler pr. brønd.For at forbedre adhæsionen af ​​HEK293T-celler tilsættes 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS, Sangon, #B640435) ved 37°C.Kamrene blev forbehandlet i 1 time og derefter fjernet med PBS.Efter 24 timer blev cellerne vasket én gang med PBS, inkuberet med 1 mM probe 3 i frisk Hanks' balancerede saltopløsning (HBSS, Gibco, #14025092) i 1 time ved 37°C og derefter inkuberet med en blå LED (460 nm) ).) blev bestrålet i 10 minutter ved stuetemperatur.Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS og fikseret med 4% formaldehyd i PBS (Sangon, #E672002) i 15 minutter ved stuetemperatur.Overskydende formaldehyd blev fjernet fra fikserede celler ved at vaske tre gange med PBS.Celler blev derefter permeabiliseret med 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) i PBS og vasket 3 gange med PBS.Fjern derefter kammeret og tilsæt til hver prøve 25 µl af en klikreaktionsblanding indeholdende 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) og 0,5 mg/ml natriumascorbat (Aladdin, nr. S105024) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.Efter en snapreaktion blev cellerne vasket seks gange med PBS indeholdende 0,05 % Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) og derefter blokeret med 5 % BSA (Abcone, #B24726) i PBST i 30 minutter ved stuetemperatur.
Til kolokaliseringsimmunfarvning blev celler inkuberet med primære antistoffer i henhold til de angivne betingelser: muse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kanin anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kanin polyklonalt anti-calnexin antistof (1:500, Abcam, #ab22595) eller kanin anti-lamin A/C monoklonalt antistof (1:500; CST, #2032) ved 4 °C natten over.Efter vask 3 gange med PBST blev celler inkuberet med sekundære antistoffer: gede-anti-kanin Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) fortyndet 1:1000, gede-anti-mus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) fortyndet 1:1000.fortynding Fortynd ved stuetemperatur i 30 minutter.Celler blev derefter vasket 3 gange med PBST og modfarvet med DAPI (Thermo, #D1306) i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.Efter 3 vaske med PBS blev celler forseglet i 50% glycerol (Sangon, #A600232) i PBS til billeddannelse.Immunofluorescerende billeder blev opnået ved hjælp af et ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokalmikroskop og ZNE 3.5-software.
Til singlet oxygen-fluorescerende billeddannelse blev celler vasket to gange med Hanks HEPES-buffer før tilsætning af 100 nM Si-DMA i Hanks HEPES-buffer (DOJINDO, #MT05).Efter eksponering for lys blev cellerne inkuberet i en C02-inkubator ved 37°C i 45 minutter.Celler blev derefter vasket to gange med Hanks' HEPES-buffer og modfarvet med Hoechst i Hanks' HEPES-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur og visualiseret ved anvendelse af et ZEISS LSM 900-konfokalmikroskop., #M36008) i HBSS-buffer indeholdende calcium og magnesium.Efter eksponering for lys eller doxorubicin (MCE, #HY-15142A) blev celler inkuberet i en CO2-inkubator ved 37°C i 10 minutter, vasket to gange med HBSS-buffer og inkuberet med Hoechst i HBSS-buffer ved stuetemperatur.minutter.Doxorubicin blev brugt som en positiv probekontrol, hvor celler blev behandlet med 20 μM doxorubicin i HBSS indeholdende 1% BSA i 30 min.Immunofluorescerende billeder blev opnået ved hjælp af et Zeiss LSM 900 konfokalmikroskop.
HEK293T-celler, der stabilt udtrykker mito-miniSOG, blev podet ved en tæthed på ca. 30% i 15 cm skåle.Efter 48 timer, når ~80 % konfluens var nået, blev cellerne vasket én gang med PBS, inkuberet med 1 mM Probe 3 i frisk HBSS-buffer i 1 time ved 37 °C og derefter belyst med en blå LED i 10 minutter i værelset temperatur..Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS, skrabet og resuspenderet i iskold PBS-buffer indeholdende EDTA-fri proteaseinhibitorer (MCE, #HY-K0011).Celler blev lyseret ved at sonikere spidsen i 1 minut (1 sekund tændt og 1 sekund slukket ved 35 % amplitude).Den resulterende blanding blev centrifugeret ved 15.871 xgi 10 minutter ved 4°C for at fjerne rester, og supernatantkoncentrationen blev justeret til 4 mg/ml under anvendelse af et BCA-proteinassaykit (Beyotime, #P0009).Kombiner 1 ml af ovenstående lysat med 0,1 mM fotonedbrydeligt biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437) og 1 mM CuSO4-inkubator med bundinkubator drej op i 1 time ved stuetemperatur.Efter en lynreaktion tilsættes blandingen til den forblandede opløsning (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i et 10 ml hætteglas.Prøverne blev blandet og centrifugeret ved 4500 g i 10 minutter ved stuetemperatur.De nedre og øvre opløsninger blev kasseret, bundfaldet blev vasket to gange med 1 ml methanol og centrifugeret ved 15871 xg i 5 minutter ved 4°C.Tilsæt 1 ml 8 M urinstof (Aladdin, nr. U111902) i 25 mM ammoniumbicarbonat (ABC, Aladdin, nr. A110539) for at opløse bundfaldet.Prøver blev rekonstitueret med 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 i 25 mM ABC) i 40 minutter ved 55°C efterfulgt af tilsætning af 15 mM frisk iodacetamid (Sangon, #A600539) ved stuetemperatur i mørke.Alkylering inden for 30 minutter..Yderligere 5 mM dithiothreitol blev tilsat for at standse reaktionen.Forbered ca. 100 µl NeutrAvidin agarose perler (Thermo, #29202) for hver prøve ved at vaske 3 gange med 1 ml PBS.Ovenstående proteomopløsning blev fortyndet med 5 ml PBS og inkuberet med forvaskede NeutrAvidin agaroseperler i 4 timer ved stuetemperatur.Perlerne blev derefter vasket 3 gange med 5 ml PBS indeholdende 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 gange med 5 ml PBS indeholdende 1 M urinstof og 3 gange med 5 ml ddH2O.Perlerne blev derefter høstet ved centrifugering og resuspenderet i 200 μl 25 mM ABC indeholdende 1 M urinstof, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) og 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinér natten over ved 37°C med rotation.Reaktionen blev standset ved at tilsætte myresyre (Thermo, # A117-50), indtil pH nåede 2-3.Perlerne blev vasket 3 gange med 1 ml PBS indeholdende 0,2% SDS, 3 gange med 1 ml PBS indeholdende 1 M urinstof og derefter 3 gange med 1 ml destilleret vand.De modificerede peptider blev frigivet ved let lysis (365 nm) i 90 minutter under anvendelse af 200 μl 70% MeOH.Efter centrifugering blev supernatanten opsamlet.Perlerne blev derefter vasket én gang med 100 μl 70% MeOH, og supernatanterne blev samlet.Prøver blev tørret i en Speedvac vakuumkoncentrator og opbevaret ved -20°C indtil analyse.
For at identificere og kvantificere singlet oxygenmodificerede peptider blev prøver genopløst i 0,1% myresyre, og 1 μg peptider blev analyseret ved hjælp af et Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massespektrometer udstyret med en nano ESI-kilde fra Tune og Xcalibur fra leverandørsoftware 4.3.Prøver blev separeret på en 75 µm x 15 cm internt pakket kapillarsøjle med 3 µm C18-materiale (ReproSil-pur, #r13.b9.) og forbundet til et EASY-nLC 1200 UHPLC-system (Thermo).Peptiderne blev adskilt ved lineær 95 minutters gradientkromatografi fra 8 % opløsningsmiddel B til 50 % opløsningsmiddel B (A = 0,1 % myresyre i vand, B = 0,1 % myresyre i 80 % acetonitril), derefter lineært forøget til 98 % B min. på 6 min ved en flowhastighed på 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos indsamler data skiftevis mellem fuld MS-scanning og MS2-scanning afhængigt af dataene.Sputteringsspændingen blev indstillet til 2,1 kV, og temperaturen af ​​iontransportkapillæren var 320°C.MS-spektre (350-2000 m/z) blev opsamlet med en opløsning på 120.000, AGC 4 × 105 og en maksimal inputtid på 150 ms.De 10 mest almindelige multipliceret opladede prækursorer i hver fuld scanning blev fragmenteret ved hjælp af HCD med en normaliseret kollisionsenergi på 30 %, et quadrupol isolationsvindue på 1,6 m/z og en opløsningsindstilling på 30.000.Et AGC-mål for tandem-massespektrometri ved brug af 5×104 og maksimal inputtid 150 ms.Den dynamiske undtagelse er sat til 30 sekunder. Ikke-tildelte ioner eller dem med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS. Ikke-tildelte ioner eller dem med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ikke-tildelte ioner eller ioner med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Uspecificerede ioner eller ioner med ladninger på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS.
De rå data behandles ved hjælp af FragPipe computerplatformen baseret på MSFragger.Masseforstyrrelser og tilsvarende aminosyrer blev bestemt ved anvendelse af en åben søgealgoritme med en prækursormassetolerance på -150 til 500 Da.Modificerede peptider blev derefter identificeret under anvendelse af histidinmodifikationer med masseforøgelser på +229,0964 og +247,1069 Da i PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Celler, der stabilt udtrykker det fusionerede miniSOG-gen, blev udpladet i 6 cm skåle.Efter at have nået ~80% konfluens blev cellerne vasket én gang med HBSS (Gibco, #14025092), derefter inkuberet med kemiske prober i HBSS i 1 time ved 37°C og belyst med blåt lys.10W LED i 20 minutter ved stuetemperatur.For at bestemme, hvilken type reaktive oxygenarter der er involveret i PDPL, 0,5 mM C-vitamin (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 blev tilsat til cellerne som supplementer.Efter vask med kold PBS blev cellerne skrabet, opsamlet i 1,5 ml centrifugerør og sonikeret med en spids i 1 min i 200 μl PBS med 1x proteaseinhibitor uden EDTA (1 s og 1 s uden, amplitude 35%).Den resulterende blanding blev centrifugeret ved 15.871 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatantkoncentrationen blev justeret til 1 mg/ml under anvendelse af et BCA-proteinassay-kit.Ca. 50 µl af ovenstående lysat blev inkuberet med 0,1 mM rhodaminazid (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand og 1 mM CuS04 i 1 time ved stuetemperatur med rotation fra bund til top.Efter klikreaktionen blev præcipitation med acetone udført ved at tilsætte 250 μl forkølet acetone til prøverne, inkubere ved -20°C i 20 minutter og centrifugere ved 6010×g i 10 minutter ved 4°C.Saml pelleten og kog i 50 µl 1x Laemmli's buffer i 10 minutter ved 95 °C.Prøver blev derefter analyseret på SDS-PAGE lange geler og visualiseret ved hjælp af Bio-rad ChemiDoc MP Touch billeddannelsessystem med Image Lab Touch software.
Ekspression og oprensning af det rekombinante miniSOG-6xHis-protein blev udført som tidligere beskrevet.Kort fortalt blev E. coli BL21(DE3)-celler (TransGen, #CD701-02) transformeret med pET21a-miniSOG-6xHis, og proteinekspression blev induceret med 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Efter cellelyse blev proteiner oprenset under anvendelse af Ni-NTA agaroseperler (MCE, nr. 70666), dialyseret mod PBS og opbevaret ved -80°C.
For et antistofbaseret in vitro-mærke-nærhedsassay blandes 100 μM oprenset miniSOG, 1 mM probe 3 og 1 μg monoklonalt anti-mærket museantistof (TransGen, #HT501-01) i PBS til et samlet reaktionsvolumen på 50 μl..Reaktionsblandingen blev bestrålet med blåt LED-lys i 0, 2, 5, 10 og 20 minutter ved stuetemperatur.Blandingen blev inkuberet med 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand og 1 mM CuS04 i 1 time ved stuetemperatur på en opadgående ryster.Efter en lynreaktion tilsættes 4x Laemmli's buffer direkte til blandingen og koges ved 95°C i 10 min.Prøver blev analyseret på SDS-PAGE geler og analyseret ved western blotting med streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Et histidinholdigt syntetisk peptid med C-terminal amidering (LHDALDAK-CONH2) blev brugt til at analysere nærliggende peptid-baseret in vitro-mærkning.I dette assay blev 100 μM oprenset miniSOG, 10 mM probe 3 og 2 μg/ml syntetisk peptid blandet i PBS i et totalt reaktionsvolumen på 50 μl.Reaktionsblandingen blev bestrålet med blåt LED-lys i 1 time ved stuetemperatur.En mikroliter prøve blev analyseret under anvendelse af et LC-MS-system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massespektrometer med MassLynx spektrumanalysesoftware).
HEK293T-celler, der stabilt udtrykker miniSOG-fusionsgenet, blev podet i 10 cm skåle til linjer med forskellig organel lokalisering (Mito, ER, Nucleus) og 15 cm skåle for Parkin-miniSOG og BRD4-miniSOG linjer.Efter at have nået ~90% konfluens, blev cellerne vasket én gang med HBSS, derefter inkuberet med probe 3 i HBSS i 1 time ved 37°C og belyst med en 10 W blå LED ved stuetemperatur.Til ikke-kontakt mærkning af Parkin blev 10 µM protoncarbonylcyanidbærer m-chlorphenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) med probe 3 i HBSS tilsat i 1 time ved 37°C.Cellelyse-, klikkemi-, reduktions- og alkyleringstrinene var de samme som beskrevet ovenfor, bortset fra at 2 mg lysat blev tilsat, og biotin PEG3-azid blev brugt i klikreaktionen i stedet for fotonedbrydeligt biotinazid.Efter berigelse blev perlerne vasket 3 gange med 5 ml PBS indeholdende 0,2% SDS, 3 gange med 5 ml PBS indeholdende 1 M urinstof og 3 gange med 5 ml PBS.Derefter blev 2 µg trypsin tilsat til 300 µl 25 mM ABC indeholdende 1 M urinstof for at spalte proteinet natten over ved 37°C.Reaktionen blev standset ved at tilsætte myresyre, indtil en pH på 2-3 var nået.Efter trypsinisering på perler blev peptidopløsningen afsaltet under anvendelse af en SOLAµ HRP-søjle (Thermo, #60209-001) og tørret i en Speedvac vakuumkoncentrator.Peptider blev genopløst i 0,1% myresyre, og 500 ng peptider blev analyseret under anvendelse af et Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massespektrometer udstyret med nano-ESI-kilden beskrevet ovenfor.Peptider blev separeret på kommercielle RP-HPLC-præsøjler (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) og analytiske RP-HPLC-søjler (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), begge fyldt med 2 μm.gradient fra 8 % til 35 % ACN på 60 minutter, derefter lineært øget til 98 % B på 6 minutter ved en strømningshastighed på 300 Nl/min.MS-spektre (350-1500 m/z) blev opsamlet med en opløsning på 60.000, AGC 4 × 105 og en maksimal inputtid på 50 ms.Udvalgte ioner blev sekventielt fragmenteret af HCD i 3 s cyklusser med en normaliseret kollisionsenergi på 30 %, et quadrupol isolationsvindue på 1,6 m/z og en opløsning på 15000. Et 5 × 104 tandem massespektrometer AGC mål og en maksimal injektionstid på 22 ms blev brugt.Den dynamiske udelukkelse er indstillet til 45 sekunder. Ikke-tildelte ioner eller dem med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS. Ikke-tildelte ioner eller dem med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ikke-tildelte ioner eller ioner med en ladning på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Uspecificerede ioner eller ioner med ladninger på 1+ og >7+ blev afvist for MS/MS.
Prøveforberedelsestrinene op til berigelsen af ​​NeutrAvidin-perlerne var de samme som i LC-MS/MS-analysen beskrevet ovenfor.Ca. 50 μg lysat blev brugt som input til ladningskontrol og 2 mg lysat blev brugt til klikreaktioner.Efter berigelse og vask med neutravidin blev de bundne proteiner elueret ved at tilsætte 50 μl Laemmli's buffer til agaroseharpiksperlerne og koge ved 95°C i 5 minutter.Kontrolbelastningsinput og perleberigede prøver blev analyseret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, #ISEQ00010) ved standard Western blot-metoder.Membranerne blev blokeret med 5 % skummetmælk (Sangon, #A600669) i TBS indeholdende 0,1 % tween-20 (TBST) og inkuberet sekventielt med primære og sekundære antistoffer.Primære antistoffer blev fortyndet 1:1000 i 5 % skummetmælk i TBST og inkuberet natten over ved 4°C.Sekundære antistoffer blev anvendt i et forhold på 1:5000 og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur.Membranerne blev visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af Chemidoc MP-billeddannelsessystemet.Alle uskårne scanninger af blots og geler i figuren præsenteres som rådata.
Primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse omfattede kanin anti-SFPQ monoklonalt antistof (CST, nr. 71992), kanin anti-FUS monoklonalt antistof (CST, nr. 67840), kanin anti-NSUN2 polyklonalt antistof (Proteintech, nr. 20854-1) AP), kanin anti-mSin3A polyklonalt antistof (Abcam, #ab3479), muse anti-tag monoklonalt antistof (TransGen, #HT201-02), muse anti-β-actin monoklonalt antistof (TransGen, #HC201-01), kanin anti -CDK2 monoklonalt antistof (ABclonal, #A0094), kanin monoklonalt antistof mod CTBP1 (ABclonal, #A11600), kanin polyklonalt antistof mod DUT (ABclonal, #A2901), kanin polyklonalt antistof mod PS54, #ABclonbital- DNAJB1 polyklonalt antistof (ABclonal, # A5504).Disse antistoffer blev anvendt i en 1:1000 fortynding i 5 % skummetmælk i TBST.De sekundære antistoffer anvendt i denne undersøgelse inkluderede anti-kanin IgG (TransGen, #HS101-01), anti-muse IgG (TransGen, #HS201-01) i en 1:5000 fortynding.
For yderligere at undersøge, om BRD4 interagerer med SFPQ, blev stabile HEK293T- og BRD4-miniSOG-celler, der overudtrykker HEK293T, udpladet i 10 cm skåle.Celler blev vasket med kold PBS og lyseret i 1 ml Pierce IP-lysebuffer (Thermo Fisher, #87787) med EDTA-fri proteaseinhibitor i 30 minutter ved 4°C.Derefter blev lysaterne opsamlet i 1,5 ml centrifugerør og centrifugeret ved 15.871 xgi 10 minutter ved 4°C.Supernatanten blev høstet og inkuberet med 5 µg anti-V5-mærket muse monoklonalt antistof (CST, #80076) natten over ved 4°C.Vask cirka 50 µl protein A/G magnetiske perler (MCE, #HY-K0202) to gange med PBS indeholdende 0,5 % Tween-20.Derefter blev cellelysaterne inkuberet med magnetiske perler i 4 timer ved 4°C med rotation fra bund til top.Derefter blev perlerne vasket fire gange med 1 ml PBST-buffer og kogt ved 95°C i 5 min.Prøver blev analyseret på SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner under anvendelse af standard Western blot-metoder.Membranerne blev blokeret i 5 % skummetmælk i TBST og inkuberet sekventielt med primære og sekundære antistoffer.Primært antistof Kanin anti-SFPQ monoklonalt antistof (CST, #71992) blev anvendt i et forhold på 1:1000 i 5 % skummetmælk i TBST og inkuberet natten over ved 4°C.Anti-kanin IgG blev anvendt i et forhold på 1:5000 og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur.Membranerne blev visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af Chemidoc MP-billeddannelsessystemet.
Alle strukturer, der blev brugt til SASA-analysen (Solvent Accessible Surface Area) blev opnået fra Protein Data Bank (PDB)52 eller AlphaFold Protein Structure Database53.Absolut SASA blev beregnet for hver rest under anvendelse af FreeSASA-programmet.Kun fuldstændige og utvetydige SASA-data for mærket histidin og dets naboer blev brugt til at opnå den gennemsnitlige SASA for hver struktur.Den relative opløsningsmiddeltilgængelighed (RSA) for hver histidin blev beregnet ved at dividere den absolutte SASA-værdi med det empiriske maksimalt mulige restoverfladeareal, der er tilgængeligt for opløsningsmidlet.Alle histidiner blev derefter klassificeret som skjulte, hvis den gennemsnitlige RSA var under 20 %, ellers eksponeret56.
Råfiler opnået i DDA-tilstand blev søgt ved hjælp af Proteome Discoverer (v2.5) eller MSfragger (Fragpipe v15.0) i den relevante SwissProt-verificerede proteindatabase indeholdende almindelige forurenende stoffer.Peptiderne krævede komplet trypsin med to manglende spaltningssteder, carbamoylmethylering som en fast modifikation og methioninoxidation som en dynamisk modifikation.Precursor- og fragmentvægttolerancer blev sat til henholdsvis 10 ppm og 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Forurenende hits blev fjernet, og proteiner blev filtreret for at opnå en falsk opdagelsesrate på <1%. Forurenende hits blev fjernet, og proteiner blev filtreret for at opnå en falsk opdagelsesrate på <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициенте <1%. Forurenende hits blev fjernet, og proteiner filtreret for at give en falsk detektionsrate på <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 %的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы for достижения уровня ложных <1%. Forurenende hits blev fjernet, og proteiner blev filtreret for at opnå en falsk positiv rate på <1%.Til kvantitativ analyse uden brug af mærker blev normaliseret proteinindhold fra tre biologiske gentagelser anvendt.Protein subcellulær lokaliseringsanalyse blev udført ved hjælp af Gene Ontology (GO) analyse fra DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 og databaser kompileret og offentliggjort af Alice Ting-gruppen.Vulkankortet blev hentet fra Perseus (v1.6.15.0). Ændringer i proteinoverflod blev testet for statistisk signifikans ved hjælp af en tosidet t-test, og proteinhits blev identificeret med abundanceændring >2 (medmindre andet er angivet) og p-værdi <0,05. Ændringer i proteinoverflod blev testet for statistisk signifikans ved hjælp af en tosidet t-test, og proteinhits blev identificeret med abundanceændring >2 (medmindre andet er angivet) og p-værdi <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Proteinindholdsfoldændringer blev testet for statistisk signifikans ved hjælp af en to-halet t-test, og proteinmatches blev identificeret med indholdsændring >2 (medmindre andet er angivet) og ap-værdi <0,05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistisk signifikans af foldændringer i proteinindhold blev testet ved hjælp af en to-halet t-test, og proteinmatches blev bestemt for indholdsændringer >2 (medmindre andet er angivet) og p-værdier <0,05.Proteininteraktionsanalyse blev udført ved hjælp af GO-analyse sammen med String-databasen.
Tre biologiske replikater blev udført med lignende resultater.Statistisk analyse blev udført med GraphPad Prism (GraphPad-software), og vulkanplot blev genereret med Perseus (v1.6.15.0).For at sammenligne de to grupper blev p-værdier bestemt ved hjælp af en tosidet Students t-test.Kun singleton-proteiner identificeret mindst to gange i forsøgsgruppen blev inkluderet i vulkanplottene, og de tilsvarende manglende værdier i kontrolgruppen blev erstattet med Perseus fra en normalfordeling, så p-værdien kunne beregnes.Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.I proteomiske analyser til statistisk analyse blev den overflod af proteiner, der optrådte i mindst to biologiske replikater, bibeholdt.Statistiske metoder blev ikke brugt til at forudbestemme prøvestørrelsen.Forsøgene er ikke tilfældige.Forskerne var ikke blinde for opgaverne under forsøget og evalueringen af ​​resultaterne.
For mere information om undersøgelsesdesign, se Nature Research Report-abstraktet, der er knyttet til denne artikel.
Massespektrometridataene opnået i denne undersøgelse blev indsendt til ProteomeXchange Consortium via iProX57-partnerlageret under datasæt-ID PXD034811 (PDPL-MS-datasæt).Rådata leveres i form af rådatafiler.Denne artikel indeholder de originale data.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Lær kvarteret at kende: Brug af nærhedsafhængig biotinylering til at karakterisere proteinkomplekser og kortlægge organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Lær kvarteret at kende: Brug af nærhedsafhængig biotinylering til at karakterisere proteinkomplekser og kortlægge organeller.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Kendskab til omgivelser: Brug af nærhedsafhængig biotinylering til at karakterisere proteinkomplekser og kortlægge organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Forstå kvarteret: brug kvarterets afhængighed af biologisk liv.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Forståelse af nærhed: karakterisering af proteinkomplekser og kortlægning af organeller ved hjælp af nærhedsafhængig biotinylering.Nuværende.Min mening.Kemisk.biologi 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Kortlægning af mikromiljøet ved at overføre Dexter-energi til immunceller.Science 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.To-proteom-skala-netværk detekterer cellespecifik remodellering af det humane interaktom.Cells 184, 3022-3040.e3028 (2021).