Nyheder

Traditionelle diagnostiske strategier til påvisning af infektionssygdomme kræver brug af benchtop-instrumenter, der ikke er egnede til point-of-care test (POCT).Emerging microfluidics er en meget miniaturiseret, automatiseret og integreret teknologi, der er et potentielt alternativ til traditionelle metoder til hurtig, billig, nøjagtig diagnostik på stedet.Molekylær diagnostiske metoder anvendes i vid udstrækning i mikrofluidiske enheder som de mest effektive metoder til påvisning af patogener.Denne gennemgang opsummerer de seneste fremskridt inden for mikrofluidbaseret molekylær diagnostik af infektionssygdomme fra både et akademisk og industrielt perspektiv.Først beskriver vi en typisk on-chip-behandling af nukleinsyrer, herunder prøveforbehandling, amplifikation og signallæsning.Derefter sammenlignes egenskaberne, fordelene og ulemperne ved de fire typer mikrofluidiske platforme.Dernæst vil vi diskutere brugen af ​​digitale assays til den absolutte kvantificering af nukleinsyrer.Både klassiske og nyere kommercielle mikrofluidik-baserede molekylære diagnostiske anordninger er opsummeret som bevis på den aktuelle markedstilstand.Endelig foreslår vi fremtidige retninger for mikrofluidisk diagnose af infektionssygdomme.
Infektionssygdomme er forårsaget af patogener, herunder bakterier, vira og parasitter, der er spredt over hele verden.I modsætning til andre sygdomme bliver patogener hurtigt inficeret og spredes mellem mennesker og værtsdyr gennem inokulering, luft og vandmedier [1].Forebyggelse af infektionssygdomme er afgørende som en folkesundhedsforanstaltning.Tre hovedstrategier til bekæmpelse af infektionssygdomme: (1) kontrol af infektionskilden;(2) afbrydelse af transmissionsvejen;(3) beskyttelse af modtagelige populationer.Blandt hovedstrategierne betragtes kontrol af infektionskilden som den vigtigste strategi på grund af dens bekvemmelighed og lave omkostninger.Hurtig diagnosticering, isolering og behandling af inficerede individer er kritiske og kræver hurtige, følsomme og nøjagtige diagnostiske strategier [2].Den nuværende diagnose af infektionssygdomme kombinerer normalt klinisk undersøgelse baseret på tegn og symptomer og laboratorieundersøgelser såsom cellekultur og molekylær diagnostik, som kræver uddannet personale, arbejdskrævende procedurer og dyrt testudstyr [3, 4].Forebyggelse af udbrud af infektionssygdomme kræver hurtig, billig og nøjagtig lokal diagnosticering, især i ressourcebegrænsede områder, hvor infektionssygdomme er almindelige og alvorlige [5], samt behandling i ørkenen eller på slagmarken, hvor nødsituationer er uforudsigelige..medicinsk behandling er begrænset [6].I denne sammenhæng er mikrofluidik en teknologi, der kombinerer mikroelektromekaniske systemteknologier, nanoteknologi eller materialevidenskab til præcis væskemanipulation [7,8,9,10], hvilket giver nye muligheder for point-of-care-detektion (POCT).) smittestoffer uden for hospitaler og laboratorier.Sammenlignet med traditionel tidskrævende diagnostik tilbyder mikrofluidisk teknologi prøve- og omkostningsbesparelser til molekylær diagnostik under sygdomsudbrud.Den globale spredning af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er forårsaget af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), så vigtigheden af ​​mikrofluidika for rettidig forebyggelse og kontrol af pandemien understreges igen [11, 12 , 13].I modsætning til traditionel diagnostik bruger mikrofluidisk POCT små bærbare enheder lige fra benchtop-analysatorer til små sidestream-teststrimler til at teste nær prøveudtagningsstedet [14].Disse tests har forenklet eller ingen prøveforberedelse, hurtig signalforstærkning og følsomme signalaflæsninger, hvilket resulterer i kort varighed og nøjagtige resultater inden for få minutter.Tilgængeligheden og masseproduktionen af ​​mikrofluidbaserede sundhedsinstrumenter har udvidet deres omkostningseffektive og direkte diagnostiske applikationer uden for hospitalet, i nærheden af ​​patienten og endda derhjemme.
Blandt de eksisterende strategier til diagnosticering af infektionssygdomme er molekylær diagnostik en af ​​de mest følsomme [15, 16].Derudover bruges molekylær diagnostik ofte som guldstandarden for kontinuerlig påvisning af COVID-19, hvilket muliggør direkte påvisning af virusspecifikke områder af RNA eller DNA før starten af ​​et immunrespons [17, 18].I den aktuelle gennemgang præsenterer vi de seneste fremskridt inden for mikrofluidik-baserede molekylære diagnostiske processer for infektionssygdomme, fra et akademisk perspektiv til fremtidige industrielle perspektiver (fig. 1).Vi vil starte med tre nøgletrin i nukleinsyredetektion: prøveforbehandling på chip, nukleinsyreamplifikation og signallæsning.Vi sammenlignede derefter forskellige typer mikrofluidiske platforme med deres struktur og funktion, hvilket viste unikke egenskaber (styrker og svagheder).Digital nukleinsyredetektion er yderligere diskuteret og givet som et eksempel på en tredje generations teknologi til absolut kvantificering af infektiøse patogenmolekyler.Derudover vil flere typiske og nyeste kommercielle POCT-enheder blive præsenteret for at demonstrere den nuværende tilstand af det mikrofluidiske POCT-marked for molekylær diagnostik.Vi vil også diskutere og forklare vores vision for fremtidige ansøgninger.
Moduler af mikrofluidchips til nukleinsyredetektion kan opdeles i tre kategorier (prøveudtagning, genkendelse og signalering) i henhold til deres funktioner [19].Blandt disse moduler realiserer prøvetagningsmodulet hovedsageligt prøvelysis og nukleinsyreekstraktion.Sensormodulet styrer hovedsageligt konverteringen og amplifikationen af ​​nukleinsyresignaler.Signalmodulet detekterer det signal, der konverteres og behandles af sensormodulet.Baseret på processen med at detektere nukleinsyrer på en chip, vil vi opsummere de forskellige chips, der kan realisere "input og output"-funktionen.
Det første trin i nukleinsyredetektion er nukleinsyreekstraktion, dvs. isolering af målnukleinsyren fra den oprindelige prøve.Nukleinsyreekstraktion udføres for at rense nukleinsyrer fra andre molekylære kontaminanter, sikre integriteten af ​​den primære struktur af nukleinsyremolekyler og optimere resultater.Nukleinsyreekstraktion kræver den nødvendige prøvelysis og nukleinsyreopsamling, hvis kvalitet og effektivitet har en enorm indflydelse på forsknings- og diagnostiske resultater.Eventuelle subtile bivirkninger under ekstraktion kan begrænse yderligere påvisning.For eksempel hæmmes polymerasekædereaktion (PCR) og loop isotermisk amplifikation (LAMP) metoder af nogle resterende organiske opløsningsmidler såsom ethanol og isopropanol i nukleinsyreisoleringsreagenser [20].Væske-væske-ekstraktion og fastfase-ekstraktion er de mest populære metoder til isolering af nukleinsyrer [21], men væske-væske-ekstraktion på en chip er ekstremt begrænset, da de reagenser, der bruges i væske-væske-ekstraktion forårsager korrosion af de fleste mikrofluidiske chips .Her fremhæver vi mikroarray-baserede fastfaseekstraktionsmetoder og sammenligner deres fordele og ulemper.
Silicium er et substratmateriale, der er kompatibelt med nukleinsyrer på grund af dets biokompatibilitet, stabilitet og lette modifikation [22].Det er vigtigt, når det modificeres med silica eller andre materialer, udviser denne komposit egenskaber til at adsorbere negativt ladede nukleinsyrer under lav pH, høj salt betingelser, mens den elueres med høj pH, lav salt opløsning.Baseret på dette fænomen er det muligt at oprense nukleinsyren.
Forskellige former for silica-baserede materialer er blevet brugt til nukleinsyreekstraktion i mikrofluidik, såsom silicaperler, pulvere, mikrofiberfiltre og silicamembraner [23, 24, 25, 26].Afhængig af materialets egenskaber kan siliciumbaserede materialer anvendes i mikrokredsløb på forskellige måder.For eksempel kan silicagranulat, pulvere og kommercielle nanofiltre simpelthen placeres i porerne eller mikrokanalerne på mikrofluidchips og hjælpe med at udvinde nukleinsyrer fra prøver [27, 28, 29].Overflademodificerede silicamembraner kan også bruges til hurtigt at oprense DNA fra patogener til lave omkostninger.For eksempel beskriver Wang et al.[30] Ved at kombinere denaturerende amplifikationsreaktioner med vesikelmedieret kædeudveksling med silicamembraner belagt med chitosan-oligosaccharider, blev et alsidigt bærbart system introduceret, som med succes detekterede 102-108 kolonidannende enheder.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., og tilstedeværelsen af ​​virussen var let synlig.Powell et al.[31] Siliciumbaserede mikroarrays blev derefter brugt til at påvise hepatitis C-virus (HCV), humant immundefektvirus (HIV), Zika-virus og humant papillomavirus og automatisk formering, hvor en 1,3 μl snoet mikroreaktor blev udviklet til at fange RNA-vira.og udføre in situ amplifikation.Ud over disse metoder spiller overflademodificerede silica-mikrosøjler også en nøglerolle i nukleinsyreekstraktion, da det modificerende materiales geometri og egenskaber i høj grad øger ekstraktionseffektiviteten.Chen et al.[32] foreslog en mikrofluidisk platform til isolering af lavkoncentrations-RNA baseret på amino-coatede siliciummikrokolonner.Denne mikrofluidiske enhed integrerer et array af 0,25 cm2 mikrosøjler på et siliciumsubstrat for at opnå højere ekstraktionseffektivitet gennem et design med højt overfladeareal til volumenforhold.Fordelen ved dette design er, at den mikrofluidiske enhed kan opnå op til 95 % nukleinsyreekstraktionseffektivitet.Disse siliciumbaserede strategier demonstrerer værdien af ​​hurtigt at isolere nukleinsyrer til lave omkostninger.I kombination med mikrofluidchips kan siliciumbaserede ekstraktionsstrategier ikke kun øge effektiviteten af ​​nukleinsyredetektion, men også lette miniaturisering og integration af analytiske enheder [20].
Magnetiske separationsmetoder bruger magnetiske partikler til at isolere nukleinsyrer i nærvær af et eksternt magnetfelt.Almindeligt anvendte magnetiske partikler omfatter Fe3O4 eller y-Fe2O3 magnetiske partikler coatet med silica, amino og carboxyl [33,34,35,36].Det karakteristiske træk ved magnetiske partikler sammenlignet med siliciumbaserede SPE-metoder er den lette manipulation og kontrol med eksterne magneter.
Ved at bruge den elektrostatiske interaktion mellem nukleinsyrer og silica, under forhold med højt salt og lav pH, adsorberes nukleinsyrer på overfladen af ​​silica-coatede magnetiske partikler, mens molekylerne under forhold med lavt salt og høj pH kan vaskes igen..Silica-coatede magnetiske perler gør det muligt at ekstrahere DNA fra store volumenprøver (400 μL) ved hjælp af magnetisk kontrolleret bevægelse [37].Som en demonstration har Rodriguez-Mateos et al.[38] brugte afstembare magneter til at kontrollere overførslen af ​​magnetiske perler til forskellige kamre.Baseret på silica-coatede magnetiske partikler kan 470 kopier/mL SARS-CoV-2 genomisk RNA ekstraheres fra spildevandsprøver til LAMP revers transkriptionsdetektion (RT-LAMP), og responsen kan aflæses inden for 1 time.det blotte øje (fig. 2a).
Enheder baseret på magnetiske og porøse materialer.Konceptuelt diagram af IFAST RT-LAMP mikrofluidisk enhed til SARS-CoV-2 RNA-detektion (tilpasset fra [38]).b Centrifugal mikroanordning til dSPE af bukkal podningsnukleinsyre (tilpasset fra [39]).c Indbygget selvforsynende prøvekoncentrator ved hjælp af et FTA®-kort (tilpasset fra [50]).d Fusion 5 filterpapir modificeret med chitosan (tilpasset fra [51]).SARS-CoV-2 svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2, RT-LAMP revers transkriptionsløkke-medieret isotermisk amplifikation, FTA finders teknologipartnere, NA nukleinsyre
Positivt ladede magnetiske partikler er ideelle til at fastgøre fosfatrygraden i en nukleinsyre.Ved en vis saltkoncentration kan de negativt ladede fosfatgrupper af nukleinsyrer være positivt ladede på overfladen af ​​de magnetiske kompositpartikler.Derfor blev der udviklet magnetiske nanopartikler med en ru overflade og en høj tæthed af aminogrupper til ekstraktion af nukleinsyrer.Efter magnetisk adskillelse og blokering kan magnetiske nanopartikler og DNA-komplekser anvendes direkte i PCR, hvilket eliminerer behovet for komplekse og tidskrævende oprensnings- og elueringsoperationer [35].Magnetiske nanopartikler belagt med negative carboxylgrupper er også blevet brugt til at adskille nukleinsyrer adsorberet på overflader i højkoncentration polyethylenglycol og natriumchloridopløsninger [36].Med disse overflademodificerede magnetiske perler er DNA-ekstraktion kompatibel med efterfølgende amplifikation.Dignan et al.[39] beskrev en automatiseret og bærbar centrifugal mikrofluidisk platform til nukleinsyreforbehandling, der tillader ikke-teknisk personale at bruge den på stedet.Derudover viser kompatibiliteten af ​​det isolerede DNA med LAMP, en metode velegnet til point-of-care nukleinsyreanalyse, yderligere minimale udstyrskrav og egnethed til kolorimetriske assays (fig. 2b).
Magnetiske perlemetoder giver mulighed for automatiseret ekstraktion, hvoraf nogle findes i kommercielle automatiserede nukleinsyreekstraktorer [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Kina) og Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Fordelene ved at kombinere magnetiske perler med mikrofluidik kan bruges til effektiv automatiseret ekstraktion af nukleinsyrer, hvilket potentielt kan fremme udviklingen af ​​molekylær diagnostik;kombinationen af ​​magnetiske perler med mikrofluidik er dog stadig stærkt afhængige af komplekse kontrolsystemer til præcis manipulation af magnetiske perler, hvilket forklarer populariteten af ​​kommercielle produkter er omfangsrige og dyre, hvilket begrænser den videre anvendelse af magnetiske perler i POCT.
Adskillige porøse materialer såsom modificerede nitrocellulosefiltre, Finders Technology Associates (FTA) kort, polyethersulfonbaseret filterpapir og glycan-coatede materialer er også blevet brugt til nukleinsyredetektion [40, 41, 42, 43, 44].Porøse fibrøse materialer såsom fibrøst papir blev først brugt til at isolere DNA ved fysisk at sammenfiltre langstrengede DNA-molekyler med fibre.Små porer fører til en stærk fysisk begrænsning af DNA-molekyler, hvilket positivt påvirker DNA-ekstraktion.På grund af de forskellige porestørrelser af fibrøst papir kan ekstraktionseffektiviteten ikke opfylde behovene for DNA-amplifikation [45, 46].FTA-kortet er et kommercielt filterpapir, der bruges inden for retsmedicin og er meget udbredt inden for andre områder af molekylær diagnostik.Ved at bruge cellulosefilterpapir imprægneret med forskellige kemikalier til at lysere cellemembranerne i prøven, er det frigivne DNA beskyttet mod nedbrydning i op til 2 år.For nylig er imprægneret cellulosepapir blevet udviklet til molekylær påvisning af forskellige patogener, herunder SARS-CoV-2, leishmaniasis og malaria [47,48,49].HIV i det isolerede plasma lyseres direkte, og den virale nukleinsyre beriges i FTA® flow-membranen indbygget i koncentratoren, hvilket muliggør effektiv produktion af nukleinsyren [50] (fig. 2c).Hovedproblemet med nukleinsyrepåvisning ved hjælp af FTA-kort er, at kemikalier som guanidin og isopropanol hæmmer efterfølgende amplifikationsreaktioner.For at løse dette problem udviklede vi Fusion 5 chitosan-modificeret filterpapir, som kombinerer fordelene ved både den fysiske sammenfletning af DNA-molekyler og fibrøst filterpapir og den elektrostatiske adsorption af DNA på chitosan-modificerede forbindelser for at opnå højeffektiv nukleinsyreekstraktion ..filterfibre [51] (fig. 2d).Tilsvarende har Zhu et al.[52] demonstrerede en chitosan-modificeret PCR-metode baseret på et in situ kapillært mikrofluidsystem til hurtig isolering og påvisning af Zika-virus-RNA.Nukleinsyrer kan adsorberes/desorberes i henholdsvis et blandet lysat/PCR-medium baseret på chitosan's tænd/sluk-switchegenskab.tænd og sluk", reagerer på pH.
Som nævnt ovenfor kombinerer disse strategier fordelene ved forskellige fastfasematerialer og øger effektiviteten af ​​nukleinsyreekstraktion i mikrofluidik.I praktiske applikationer er brugen af ​​disse materialer i store mængder uøkonomisk, og korrekt overfladebehandling eller overflademodifikation af almindelige materialer med disse materialer kan også bevare deres funktion.Derfor menes det, at implementeringen af ​​disse strategier efter en pilotundersøgelse kan reducere omkostningerne.
Nukleinsyretestning på mikrofluidplatforme bruger ofte små prøvevolumener (< 100 µl), og kræver derfor amplifikation af målnukleinsyrerne med specifikke prober til omdannelse til et signal, der er praktisk til nedstrøms detektion (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]. Nukleinsyretestning på mikrofluidplatforme bruger ofte små prøvevolumener (< 100 µl), og kræver derfor amplifikation af målnukleinsyrerne med specifikke prober til omdannelse til et signal, der er praktisk til nedstrøms detektion (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Ved testning af nukleinsyrer på mikrofluidiske platforme bruges ofte små prøvevolumener (<100 µL), så amplifikationen af ​​målnukleinsyrer med specielle prober er påkrævet for at konvertere det til et signal, der er praktisk til efterfølgende detektion (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 m ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Påvisning af nukleinsyrer på mikrofluidiske platforme bruger normalt små prøvevolumener (<100 μl), hvilket kræver amplifikation af målnukleinsyrer med specielle prober for at konvertere dem til signaler til efterfølgende detektion (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]] .Nukleinsyreamplifikation i mikrofluidik kan også fremskynde reaktioner, optimere detektionsgrænser, reducere prøvekravene og forbedre detektionsnøjagtigheden [55, 56].I de senere år, med realiseringen af ​​hurtig og nøjagtig detektion, er forskellige nukleinsyreamplifikationsmetoder blevet anvendt i mikrofluidik, herunder PCR og nogle isotermiske amplifikationsreaktioner.Dette afsnit vil opsummere metoder til nukleinsyredetektion baseret på mikrofluidiske systemer.
PCR er en simulering af DNA-replikationsprocessen for en organisme, hvis teori er beskrevet i detaljer andetsteds og ikke vil blive diskuteret her.PCR kan amplificere en meget lille mængde mål-DNA/RNA med en eksponentiel hastighed, hvilket gør PCR til et kraftfuldt værktøj til hurtig påvisning af nukleinsyrer.I de seneste årtier er mange bærbare mikrofluidiske enheder udstyret med PCR termiske cyklingssystemer blevet udviklet til at imødekomme behovene for point-of-care diagnostik [57, 58].On-chip PCR kan opdeles i fire typer (konventionel, kontinuerlig flow, rumligt switchet og konvektiv PCR) i henhold til forskellige temperaturkontrolmetoder [59].For eksempel har Gee et al.[60] udviklede en direkte revers transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) metode på deres egen mikrofluidisk platform til multipleks påvisning af SARS-CoV-2, influenza A og B virus i halspodningsprøver (fig. 3a).Park et al.[61] byggede en simpel patogenanalysechip ved at integrere tyndfilm-PCR, elektroder og et fingerbetjent polydimethylsiloxan-baseret mikrofluidmodul.Begge værker legemliggør imidlertid de almindelige mangler ved konventionel PCR.PCR kræver termisk cykling, hvilket begrænser yderligere miniaturisering af enheden og reduceret testtid.
Udviklingen af ​​kontinuert flow baseret mikrofluidisk og space-switched PCR er afgørende for at løse dette problem.Ved at bruge en lang serpentinkanal eller en kort lige kanal kan PCR med kontinuerlig flow give hurtig amplifikation ved aktivt at cirkulere reagenser i tre forvarmningszoner med en off-chip pumpe.Denne operation undgår med succes overgangsfasen mellem forskellige reaktionstemperaturer og reducerer således testtiden betydeligt [62] (fig. 3b).I en anden undersøgelse af Jung et al.[63] foreslog en ny roterende genetisk PCR-analysator, der kombinerer egenskaberne ved fast og flow-PCR til ultrahurtig og multipleks revers transkriptions-PCR (fig. 3c).Til nukleinsyreamplifikation vil PCR-mikrochippen blive roteret gennem tre varmeblokke ved forskellige temperaturer: 1. Denatureringsblok 94°C, 2. Annealingsblok ved 58°C, 3. Ekspansionsblok ved 72°C.
Anvendelse af PCR i mikrofluidik.Skematisk repræsentation af dirRT-qPCR på en mikrofluidisk platform (tilpasset fra [60]).b Skematisk repræsentation af et kontinuert flow PCR-mikroarray baseret på en serpentinkanal (tilpasset fra [62]).c Skematisk repræsentation af en roterende PCR genetisk analysator, bestående af en mikrochip, tre varmeblokke og en stepmotor (tilpasset fra [63]).d Diagram over termokonvektion PCR med centrifugering og opsætning (tilpasset fra [64]).DirRT-qPCR, direkte kvantitativ revers transkriptionspolymerasekædereaktion
Ved at bruge kapillærer og loops eller endda tynde plader kan konvektions-PCR hurtigt amplificere nukleinsyrer ved naturlig fri termisk konvektion uden behov for en ekstern pumpe.For eksempel blev en cyklisk olefinpolymer mikrofluidisk platform udviklet på et fremstillet roterende varmetrin, der bruger termisk cykling med centrifugering i en PCR loop mikrokanal [64] (fig. 3d).Reaktionsopløsningen drives af termisk konvektion, som kontinuerligt udveksler høj og lav temperatur i en mikrokanal med en ringformet struktur.Hele amplifikationsprocessen kan afsluttes på 10 minutter med en detektionsgrænse på 70,5 pg/kanal.
Som forventet er hurtig PCR et kraftfuldt værktøj til fuldt integrerede prøve-respons molekylær diagnostik og multipleks analysesystemer.Hurtig PCR reducerer markant den tid, der kræves til at opdage SARS-CoV-2, hvilket bidrager til effektiv kontrol af COVID-19-pandemien.
PCR kræver en kompleks termisk cycler, der ikke er egnet til POCT.For nylig er isotermiske amplifikationsteknikker blevet anvendt til mikrofluidik, herunder men ikke begrænset til LAMP, rekombinasepolymerase-amplifikation (RPA) og amplifikation baseret på nukleinsyresekvenser [65,66,67,68].Med disse teknikker amplificeres nukleinsyrer ved en konstant temperatur, hvilket letter skabelsen af ​​billige, meget følsomme bærbare POCT-enheder til molekylær diagnostik.
High-throughput mikrofluidik-baserede LAMP-assays muliggør multipel påvisning af infektionssygdomme [42, 69, 70, 71].I kombination med et centrifugalt mikrofluidsystem kan LAMP yderligere lette automatiseringen af ​​nukleinsyredetektion [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip blev udviklet til visuel påvisning af flere parallelle bakterier ved hjælp af LAMP [76] (fig. 4a).Ved brug af optimeret LAMP i assayet var fluorescenssignal-til-støj-forholdet ca. 5 gange, og detektionsgrænsen nåede 7,2 kopier/μl genomisk DNA. Ydermere blev eksistensen af ​​fem almindelige fordøjelsesbakteriepatogener, herunder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualiseret baseret på metoden i < 60 min. Ydermere blev eksistensen af ​​fem almindelige fordøjelsesbakteriepatogener, herunder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualiseret baseret på metoden i < 60 min.Desuden blev tilstedeværelsen af ​​fem almindelige bakterielle patogener i fordøjelseskanalen, herunder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualiseret ved hjælp af denne metode på mindre end 60 minutter.Å此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 消化道 细菌病 细菌病 存在 ， ， 芽孢杆菌 、 大 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 芽孢杆菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPDerudover blev tilstedeværelsen af ​​fem almindelige bakterielle gastrointestinale patogener, inklusive Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius og Vibrio parahaemolyticus, visualiseret ved hjælp af denne metode på mindre end 60 minutter.
Fordelene ved LAMP i mikrofluidik inkluderer blandt andet hurtig respons og miniaturiseret detektion.På grund af reaktionstemperaturen (omkring 70°C) dannes der imidlertid uundgåeligt aerosoler under LAMP, hvilket resulterer i en høj falsk positiv rate.Analysespecificitet, primerdesign og temperaturkontrol skal også optimeres til LAMP.Derudover er chipdesign, der implementerer flere måldetektion på en enkelt chip, af stor værdi og bør udvikles.Derudover er LAMP velegnet til multi-purpose detektion integreret i én chip, hvilket er af stor betydning, men der er stadig meget plads til udvikling.
Den høje falsk positive rate af LAMP kan delvist reduceres med RPA, da den relativt lave reaktionstemperatur (~37 °C) resulterer i relativt få fordampningsproblemer [77].I RPA-systemet initierer to modsatte primere DNA-syntese ved binding til en rekombinase, og amplifikation kan fuldføres inden for 10 minutter [78,79,80,81].Derfor er hele RPA-processen meget hurtigere end PCR eller LAMP.I de senere år har mikrofluidisk teknologi vist sig yderligere at forbedre hastigheden og nøjagtigheden af ​​RPA [82,83,84].For eksempel har Liu et al.[85] udviklede en mikrofluidisk integreret lateral flow polymerase rekombinase amplifikationsanalyse til hurtig og følsom påvisning af SARS-CoV-2 ved at integrere revers transkription RPA (RT-RPA) og et universelt lateral flow teststrimmel detektionssystem.ind i et enkelt mikrofluidsystem.figur 4b).Detektionsgrænsen er 1 kopi/µl eller 30 kopier/prøve, og detektionen kan gennemføres på cirka 30 minutter.Kong et al.har udviklet en bærbar mikrofluidisk enhed.[86] brugte kropstemperatur og et mobiltelefonbaseret fluorescensdetektionssystem til hurtigt og direkte at detektere HIV-1 DNA ved hjælp af RPA (figur 4c).Den bærbare RPA-analyse detekterer 100 kopier/ml af målsekvensen inden for 24 minutter, hvilket viser et stort potentiale for hurtig diagnosticering af HIV-1-inficerede spædbørn i ressourcebegrænsede omgivelser.
Isotermisk forstærkning i point-of-care test (POCT).Udvikling og produktion af spin og reaktion SlipChip.Efter plasmasvejsning blev top- og bundspånerne samlet med et sæt møtrikker for at danne den endelige chip (tilpasset fra [76]).b Skematisk af MI-IF-RPA-systemet til COVID-19-detektion (tilpasset fra [85]).c Skematisk over en bærbar RPA-test til hurtig påvisning af HIV-1 DNA (tilpasset fra [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, human immundefektvirus HIV, RPA rekombinase polymerase amplifikation, LED lysdiode, MI-IF-Low-RPA Integrated Microbinase Polymerase Forstærkning
Mikrofluidbaseret RPA udvikler sig hurtigt, men omkostningerne ved chipfremstilling og reaktionsforbrug er for høje og skal reduceres for at øge tilgængeligheden af ​​denne teknologi.Derudover kan den høje følsomhed af RPA påvirke amplifikationen af ​​ikke-specifikke produkter, især ved tilstedeværelse af kontaminering.Disse begrænsninger kan påvirke anvendelsen af ​​RPA i mikrofluidiske systemer og fortjener yderligere optimering.Veldesignede primere og prober til forskellige mål er også nødvendige for at forbedre gennemførligheden af ​​RPA-baserede mikrofluidstrategier i POCT.
Cas13 og Cas12a har evnen til tilfældigt at spalte nukleinsyrer og kan således udvikles som detektions- og diagnostiske værktøjer.Cas13 og Cas12a aktiveres ved binding til henholdsvis mål-DNA eller RNA.Når først det er aktiveret, begynder proteinet at spalte andre nærliggende nukleinsyrer, hvorefter guide-RNA'er rettet mod patogenspecifikke nukleinsyrer kan spalte slukkede fluorescerende prober og frigive fluorescens.Baseret på denne teori har Kellner et al.[87] udviklede en Cas13-baseret metode [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], og Broughton et al.[88] udviklede en anden tilgang baseret på Cas12a [CRISPR Trans Reporter rettet mod DNA-endonuklease (DTECR)].
I de senere år er der kommet forskellige metoder til påvisning af nukleinsyrer baseret på CRISPR [89, 90].Konventionelle CRISPR-baserede metoder er ofte tidskrævende og arbejdskrævende på grund af flere procedurer, herunder nukleinsyreekstraktion, amplifikation og CRISPR-detektion.Udsættelse af væsker for luft kan øge chancen for falske positive resultater.På baggrund af ovenstående har CRISPR-baserede systemer et stærkt behov for optimering.
En pneumatisk styret mikrofluidisk platform, der kan udføre 24 analyser parallelt, er blevet udviklet til CRISPR-Cas12a og CRISPR-Cas13a detektionsapplikationer [91].Systemet er udstyret med en fluorescensdetektionsanordning, der omgår nukleinsyreamplifikation og automatisk detekterer femtomolære DNA- og RNA-prøver.Chen et al.[92] integreret rekombinase-amplifikation med CRISPR-Cas12a-systemet i centrifugal mikrofluidik (fig. 5a).Dette arbejde overvinder vanskeligheden ved at integrere disse to processer, fordi Cas12a kan fordøje messenger-DNA og hæmme amplifikationsprocessen.Derudover har Chen et al.[92] forlagrede desuden reaktionsreagenserne i en centrifugal mikrofluidisk kontrol for automatisk at fuldføre hele processen.I et andet arbejde har Silva et al.[93] udviklede en diagnostisk metode uden CRISPR/Cas12a-forstærkning og en smartphone til at detektere SARS-CoV-2 (fig. 5b).Dette assay, kendt som et mobiltelefon-baseret amplifikationsfrit system, inkluderer et CRISPR/Cas-afhængigt enzym, der er baseret på smartphone-visualisering af katalase-genererede boblesignaler i mikrofluidkanaler.Følsom påvisning af mindre end 50 kopier/µl nukleinsyre uden præ-amplifikation, hele processen fra prøveinjektion til signalaflæsning tager kun 71 minutter.
Nukleinsyrepåvisningsmetoder baseret på CRISPR.Centrifugal POCT til integreret molekylær diagnostik baseret på CRISPR (tilpasset fra [92]).b Udvikling af CASCADE-testen til smartphone-baseret analyse af SARS-CoV-2 (tilpasset [93]).RAA-rekombinase-amplifikation, PAM-tilstødende protospacer-motiv, CRISPR-klyngede korte palindromiske gentagelser med regelmæssige intervaller, CASCADE-system uden mobiltelefonamplifikation med CRISPR/CAS-afhængige enzymer, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid EDC
Som det sidste trin i nukleinsyredetektion afspejler signaldetektion direkte diagnostiske resultater og er en kritisk faktor i udviklingen af ​​en effektiv, følsom og nøjagtig POCT.Signaler kan læses ved hjælp af forskellige metoder såsom fluorescerende, elektrokemiske, kolorimetriske og magnetiske strategier.I dette afsnit beskriver vi begrundelsen for hver tilgang og sammenligner den molekylære diagnostik af infektionssygdomme i mikrofluidik.
Fluorescens-baserede strategier bruges i vid udstrækning til POCT-diagnostik af infektionssygdomme på grund af deres bemærkelsesværdige fordele med fremragende følsomhed, lave omkostninger, nem betjening og point-of-care-analyse [94, 95].Disse strategier bruger mærkede fluoroforer såsom fluorescerende farvestoffer og nanomaterialer til at skabe et detekterbart signal (fluorescensforøgelse eller quenching).Dette fund tyder på, at fluorescensbaserede strategier kan opdeles i direkte fluorescensmærkning, signal-on og signal-off fluorescensdetektion [96].Direkte fluorescerende mærkedetektering bruger specielle fluorescerende mærker til at mærke specifikke ligander, der genererer en specifik mængde fluorescens, når de er selektivt bundet til et mål.For signalbaseret fluorescensdetektion er kvaliteten af ​​det fluorescerende signal positivt relateret til størrelsen af ​​interesse.Fluorescensintensiteten er ubetydelig i fravær af et mål og kan påvises, når en tilstrækkelig mængde mål er til stede.Omvendt er intensiteten af ​​fluorescens detekteret ved "signal-off" fluorescens omvendt proportional med mængden af ​​mål, når først en maksimal værdi og falder gradvist, efterhånden som målet forstørres.For eksempel ved at bruge den CRISPR-Cas13a målafhængige trans-spaltningsmekanisme, Tian et al.[97] udviklede en ny genkendelsesstrategi til at detektere RNA'er, der omgår revers transkription direkte (fig. 6a).Ved binding til komplementære mål-RNA'er kan CRISPR-Cas13-RNA-komplekset aktiveres, hvilket udløser transcollateral spaltning af ikke-specifikke reporter-RNA'er.Den fluorescensmærkede reporter [fluorofor (F)] standses af quencheren (Q) intakt og fluorescerer, når den spaltes af det aktiverede kompleks.
Fordelen ved elektrokemisk detektion er høj detektionshastighed, nem produktion, lav pris, nem at bære og automatisk kontrol.Det er en kraftfuld analysemetode til POCT-applikationer.Baseret på grafen-felteffekttransistorer Gao et al.[98] udviklede en nanobiosensor til multipleks påvisning af borreliose-antigener fra Borrelia burgdorferi-bakterier med en detektionsgrænse på 2 pg/mL (fig. 6b).
Kolorimetriske analyser er blevet brugt i POCT-applikationer, der drager fordel af fordelene ved bærbarhed, lave omkostninger, nem forberedelse og visuel læsning.Kolorimetrisk detektion kan bruge oxidation af peroxidase eller peroxidase-lignende nanomaterialer, aggregering af nanomaterialer og tilføjelse af indikatorfarvestoffer til at konvertere information om tilstedeværelsen af ​​målnukleinsyrer til synlige farveændringer [99, 100, 101].Navnlig er guldnanopartikler meget brugt i udviklingen af ​​kolorimetriske strategier, og på grund af deres evne til at inducere hurtige og signifikante farveændringer er der stigende interesse for udviklingen af ​​POCT kolorimetriske platforme til in situ diagnose af infektionssygdomme [102].Med en integreret centrifugal mikrofluidisk enhed [103] kan fødevarebårne patogener i kontaminerede mælkeprøver automatisk påvises på niveau med 10 bakterieceller, og resultaterne kan aflæses visuelt inden for 65 minutter (fig. 6c).
Magnetiske sensingsteknikker kan nøjagtigt detektere analytter ved hjælp af magnetiske materialer, og der har været betydelig interesse for POCT-applikationer i de seneste årtier.Magnetiske registreringsteknikker har nogle unikke fordele, såsom billige magnetiske materialer frem for dyre optiske komponenter.Imidlertid forbedrer brugen af ​​et magnetfelt detektionseffektiviteten og reducerer prøveforberedelsestiden [104].Derudover viser resultaterne af magnetisk sondering høj specificitet, følsomhed og højt signal-til-støj-forhold på grund af det ubetydelige magnetiske baggrundssignal fra biologiske prøver [105].Sharma et al.integreret en magnetisk tunnelforbindelsesbaseret biosensor i en bærbar mikrochipplatform.[106] til multipleks påvisning af patogener (fig. 6d).Biosensorer detekterer følsomt subnanomolære nukleinsyrer isoleret fra patogener.
Typisk signaldetektionsmetode.Konceptet med hyperlokaliseret detektion af Cas13a (tilpasset fra [97]).b Graphene nanobiosensor FET i kombination med Lyme GroES scFv (tilpasset fra [98]).c Kolorimetriske indikationer for multipleks påvisning af fødevarebårne patogener i en centrifugal mikrofluidisk chip: nr. 1 og nr. 3 prøver med målpatogener, og nr. 2, nr. 4 og nr. 5 prøver uden målpatogener (tilpasset fra [103]) .d Biosensor baseret på en magnetisk tunnelforbindelse, inklusive en platform, en indbygget blokeringsforstærker, en styreenhed og en strømforsyning til signalgenerering/-optagelse (tilpasset fra [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicon, PMMA polymethylmethacrylat
På trods af de fremragende egenskaber ved ovennævnte detektionsmetoder har de stadig ulemper.Disse metoder sammenlignes (tabel 1), herunder nogle applikationer med detaljer (fordele og ulemper).
Med udviklingen af ​​mikrofluidik, mikroelektromekaniske systemer, nanoteknologi og materialevidenskab, er brugen af ​​mikrofluidchips til påvisning af infektionssygdomme konstant fremme [55,96,107,108].Præcis manipulation af miniatureudstyr og væsker bidrager til diagnostisk nøjagtighed og omkostningseffektivitet.Derfor er der til videreudvikling arbejdet på at optimere og opgradere chipsene, hvilket har resulteret i forskellige mikrofluidchips med forskellige strukturer og funktioner.Her introducerer vi kort flere almindelige typer af mikrofluidiske platforme og sammenligner deres egenskaber (fordele og ulemper).Derudover fokuserer de fleste af eksemplerne nedenfor primært på bekæmpelse af SARS-CoV-2.
LOCC'er er de mest almindelige miniaturiserede komplekse analytiske systemer, og deres operationer er meget miniaturiseret, integreret, automatiseret og paralleliseret fra prøveinjektion og -forberedelse, flowkontrol og væskedetektion [109, 110].Væsker manipuleres gennem omhyggeligt designet geometri og samspillet mellem mange fysiske effekter såsom trykgradienter, kapillærvirkning, elektrodynamik, magnetiske felter og akustiske bølger [111].LOCC viser fremragende fordele i high-throughput screening og multipel detektion med hurtig analysehastighed, lille prøvestørrelse, lavt strømforbrug og høj styrings- og driftseffektivitet;LOCC-enheder er dog meget sarte, og fremstilling, emballering og grænseflader.Men multipleksing og genbrug står over for enorme vanskeligheder [96].Sammenlignet med andre platforme har LOCC unikke fordele i form af maksimal applikationsdiversitet og bedste teknologikompatibilitet, men dens ulemper er også åbenlyse, nemlig høj kompleksitet og dårlig repeterbarhed.Afhængighed af eksterne pumper, som ofte er omfangsrige og dyre, begrænser deres anvendelse i POCT yderligere.
Under COVID-19-udbruddet fik LOCC stor opmærksomhed.Samtidig er der flere nye chips, der kombinerer flere teknologier.For eksempel er smartphones nu meget brugt som bærbare analyseenheder og har et stort potentiale for LOCC-integration.Sun et al.[21] fremstillede en mikrofluidisk chip, der tillader multipleksing af specifikke nukleinsyresekvenser af fem patogener, inklusive SARS-CoV-2, ved hjælp af LAMP og analyserede dem ved hjælp af en smartphone inden for 1 time efter afslutningen af ​​reaktionen.Som et andet eksempel, Sundah et al.[112] skabte en molekylær switch [katalytisk amplifikation ved molekylær overgangstilstandsswitch (CATCH)] til direkte og følsom påvisning af SARS-CoV-2 RNA-mål ved hjælp af smartphones. CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og opnår overlegen ydeevne (ca. 8 RNA-kopier/μl; < 1 time ved stuetemperatur) [112]. CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og opnår overlegen ydeevne (ca. 8 RNA-kopier/μl; < 1 time ved stuetemperatur) [112]. Fangstd CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og giver fremragende gennemløb (ca. 8 RNA-kopier/µl; < 1 time ved stuetemperatur) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小温下 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小温下 CATCH совместим с портативными LOCC og обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкрет] РНК/мкрет [1 копий РНК/1 превосходной производительностью; CATCH er kompatibel med bærbare LOCC'er og har fremragende ydeevne (ca. 8 RNA-kopier/µl; < 1 time ved stuetemperatur) [112].Derudover bruger LOCC-enheder til molekylær diagnostik også nogle drivkræfter såsom vakuum, stræk og elektriske felter.Kang et al.[113] demonstrerede en ultrahurtig nanoplasma-på-en-chip-PCR i realtid til hurtig og kvantitativ diagnose af COVID-19 i felten ved hjælp af en vakuum-plasmonisk flydende PCR-chip.Li et al.[114] udviklede efterfølgende en strækdrevet mikrofluidisk chip, der muliggjorde diagnosen COVID-19.Platformen bruger RT-LAMP-amplifikationssystemet til at bestemme, om en prøve er kvalitativt positiv eller negativ.Efterfølgende har Ramachandran et al.[115] opnåede passende elektriske feltgradienter ved hjælp af isotachoforese (ITP), en selektiv ionfokuseringsteknik implementeret i mikrofluidik.Med ITP kan mål-RNA fra rå nasopharyngeale podningsprøver automatisk renses.Derefter Ramachandran et al.[115] Ved at kombinere denne ITP-oprensning med ITP-forstærkede LAMP- og CRISPR-assays påviste SARS-CoV-2 i human nasopharyngeal podning og kliniske prøver på omkring 35 minutter.Derudover dukker der hele tiden nye ideer op.Jadhav et al.[116] foreslog et diagnostisk skema baseret på overfladeforstærket Raman-spektroskopi i kombination med en mikrofluidisk enhed indeholdende enten lodret orienterede guld/sølv-coatede kulstof-nanorør eller elektrospundne mikro/nanorør til engangsbrug.Membranfunktionaliserede indbyggede filtermikrokanaler er til engangsbrug.Enheden adsorberer vira fra forskellige kropsvæsker/eksudationer såsom spyt, nasopharynx og tårer.Således er virustiteren rigelig, og virussen kan identificeres nøjagtigt ved Raman-signaturen.
LOAD er en centrifugal mikrofluidisk platform, hvor alle processer styres af en frekvensprotokol, der roterer et mikrostruktureret substrat [110].LOAD-enheden er karakteriseret ved at bruge centrifugalkraften som en vigtig drivkraft.Væsker er også underlagt kapillær-, Euler- og Coriolis-kræfter.Ved hjælp af en centrifugeanordning udføres analyser i kontinuerlig væskedrift fra en radial indadgående til udadgående position, hvilket eliminerer behovet for yderligere eksterne slanger, pumper, aktuatorer og aktive ventiler.Kort sagt, en enkelt kontrolmetode forenkler betjeningen.De kræfter, der virker på væsken i den samme mikrofluidkanal i samme afstand fra belastningscentret, er ens, hvilket gør det muligt at gentage kanalstrukturen.LOAD udstyr er således enklere og mere økonomisk at designe og fremstille end konventionelt LOCC udstyr, mens reaktionerne stort set er uafhængige og paralleliserede;på grund af centrifugaludstyrets høje mekaniske styrke er tilgængeligt spånmateriale imidlertid begrænset, og små volumener er vanskelige.til bilen.Samtidig er de fleste LOAD-enheder kun designet til engangsbrug, hvilket er dyrt for detektering i stor skala [96, 117, 118, 119].
I de seneste årtier har LOAD, der betragtes som en af ​​de mest lovende mikrofluidiske enheder, fået betydelig opmærksomhed fra forskere og producenter.LOAD har således vundet bred accept og er blevet brugt til molekylær diagnostik af infektiøse patogener [120, 121, 122, 123, 124], især under COVID-19-udbruddet.For eksempel ved udgangen af ​​2020, Ji et al.[60] demonstrerede et direkte RT-qPCR-assay til hurtig og automatiseret parallel detektion af SARS-CoV-2 og influenza A- og B-infektioner i svælgpodningsprøver.Derefter Xiong et al.[74] præsenterede en LAMP-integreret diskoid mikrofluidisk platform til hurtig, nøjagtig og samtidig påvisning af syv humane respiratoriske coronavirusser, inklusive SARS-CoV-2, inden for 40 minutter.I begyndelsen af ​​2021, de Oliveira et al.[73] demonstrerede en polystyren toner centrifugal mikrofluidisk chip, manuelt betjent med en fingerspidsrotator, til RT-LAMP molekylær diagnose af COVID-19.Efterfølgende har Dignan et al.[39] præsenterede en automatiseret bærbar centrifuge-mikroenhed til oprensning af SARS-CoV-2 RNA direkte fra bukkale podningssektioner.Medved et al.[53] foreslog et indbygget SARS-CoV-2 aerosol prøveudtagningssystem med en lille volumen roterende mikrofluidisk fluorescerende chip med en detektionsgrænse på 10 kopier/μL og en minimumscyklustærskel på 15 minutter.Suarez et al.[75] rapporterede for nylig udviklingen af ​​en integreret modulær centrifugal mikrofluidisk platform til direkte påvisning af SARS-CoV-2 RNA i varmeinaktiverede nasopharyngeale podningsprøver ved hjælp af LAMP.Disse eksempler viser de store fordele og løfter ved LOAD i den molekylære diagnostik af COVID-19.
I 1945 præsenterede Muller og Clegg [125] første gang mikrofluidkanaler på papir ved hjælp af filterpapir og paraffin.I 2007 skabte Whitesides-gruppen [126] den første funktionelle papirplatform til protein- og glukosetestning.Papir er blevet et ideelt substrat til mikrofluidik.Papiret har iboende egenskaber såsom hydrofilicitet og porøs struktur, fremragende biokompatibilitet, let vægt, fleksibilitet, foldbarhed, lav pris, brugervenlighed og bekvemmelighed.Klassiske µPAD'er består af hydrofile/hydrofobe strukturer bygget på papirsubstrater.Afhængigt af den tredimensionelle struktur kan μPAD'er opdeles i todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) μPAD'er.2D µPAD'er produceres ved at danne hydrofobe grænser for at danne mikrofluidiske kanaler, mens 3D µPAD'er normalt er lavet af stakke af lag af 2D mikrofluidisk papir, nogle gange ved papirfoldning, slipteknikker, åbne kanaler og 3D-print [96].Vandige eller biologiske væsker på μPAD'en styres primært af kapillarkraft uden en ekstern strømkilde, hvilket letter foropbevaring af reagenser, prøvehåndtering og multipleksdetektion.Imidlertid hæmmes nøjagtig flowkontrol og multipleksdetektion af utilstrækkelig detektionshastighed, følsomhed og genanvendelighed [96, 127, 128, 129, 130].
Som en usædvanlig mikrofluidisk platform er μPAD blevet bredt fremmet og udviklet til molekylær diagnose af infektionssygdomme såsom HCV, HIV og SARS-CoV-2 [131, 132].Til selektiv og følsom påvisning af HCV, Tengam et al.[133] udviklede en ny biosensor baseret på fluorescerende papir ved hjælp af en meget specifik nukleinsyreprobe baseret på pyrrolidinylpeptid.Nukleinsyrer immobiliseres kovalent på delvist oxideret cellulosepapir ved reduktiv alkylering mellem aminogrupper og aldehydgrupper, og detektion er baseret på fluorescens.Disse signaler kan aflæses af en specialfremstillet gadget med et bærbart fluorescerende kamera i kombination med et mobiltelefonkamera.Efterfølgende har Lu et al.[134] designede en papirbaseret fleksibel elektrode baseret på nikkel/guld nanopartikler/kulstofnanorør/polyvinylalkohol organometalliske rammekompositter til HIV-måldetektion ved DNA-hybridisering ved hjælp af methylenblåt som en DNA-redox-indikator.For nylig har Chowdury et al.[135] præsenterede et hypotetisk platformdesign til point-of-care µPAD-testning ved hjælp af råt patientspyt i kombination med LAMP og bærbar billedteknologi til COVID-19 analytdetektion.
Laterale strømningstests styrer væsker ved hjælp af kapillarkræfter og kontrollerer væskebevægelser ved befugtning og karakteristika af porøse eller mikrostrukturerede substrater.De laterale flow-anordninger består af prøve, konjugat, inkubator og detektion og absorberende puder.Nukleinsyremolekylerne i LFA genkender specifikke bindere, der er forudlagret på bindingsstedet og binder som komplekser.Når væsken passerer gennem inkubations- og detektionspladerne, fanges komplekserne af de indfangningsmolekyler, der er placeret på test- og kontrollinjerne, og viser resultater, der kan aflæses direkte for det blotte øje.Typisk kan LFA gennemføres på 2-15 minutter, hvilket er hurtigere end traditionel opdagelse.På grund af den specielle mekanisme kræver LFA få operationer og kræver ikke ekstra udstyr, hvilket gør den meget brugervenlig.Det er nemt at fremstille og miniaturisere, og prisen på papirbaserede substrater er lavere.Det bruges dog kun til kvalitativ analyse, og kvantitativ påvisning er meget vanskelig, og multiplekseringsevnen og gennemløbet er meget begrænset, og kun én tilstrækkelig nukleinsyre kan påvises ad gangen [96,110,127].
Selvom de fleste anvendelser af LFA er fokuseret på immunoassays, er brugen af ​​LFA til molekylær diagnostik i mikrofluidchips også effektiv og populær [136].I tilfælde af hepatitis B-virus, HIV og SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] foreslog en opkonverterende nanopartikel LFA-platform og demonstrerede alsidigheden af ​​denne miniaturiserede og bærbare platform gennem følsom og kvantitativ påvisning af flere mål såsom HBV-nukleinsyre.Derudover har Fu et al.[138] demonstrerede en ny LFA baseret på overfladeforstærket Raman-spektroskopi til kvantitativ analyse af HIV-1-DNA ved lave koncentrationer.Til hurtig og følsom påvisning af SARS-CoV-2, Liu et al.[85] udviklede en mikrofluidik-integreret RPA-lateral flowanalyse ved at kombinere RT-RPA og et universelt lateralt flowdetektionssystem i et enkelt mikrofluidisk system.
Anvendelsen af ​​forskellige mikrofluidiske platforme varierer afhængigt af specifikke undersøgelser, og udnytter platformens muligheder og fordele fuldt ud.Med overkommelige ventiler, pumper og kanaler er LOCC den mest omfattende platform for applikationsdiversitet og interoperabilitet med det største udviklingsrum.Derfor håber og anbefaler vi, at de nyeste undersøgelser gennemføres på LOCC som et første forsøg, og at forholdene optimeres.Derudover forventes mere effektive og præcise metoder at blive opdaget og brugt i systemet.LOAD udmærker sig ved præcis kontrol af væsker fra eksisterende LOCC-enheder og demonstrerer unikke fordele i enkeltdrev ved centrifugalkraft uden behov for eksterne drev, mens parallelle reaktioner kan være adskilte og synkroniserede.Således vil LOAD i fremtiden blive den vigtigste mikrofluidiske platform med færre manuelle operationer og mere modne og automatiserede teknologier.µPAD-platformen kombinerer fordelene ved LOCC og papirbaserede materialer til lavpris, engangsdiagnostik.Derfor bør den fremtidige udvikling fokusere på bekvemme og veletablerede teknologier.Derudover er LFA velegnet til detektion med det blotte øje, og lover at reducere prøveforbruget og fremskynde detektion.En detaljeret platformssammenligning er vist i tabel 2.
Digitale analyser opdeler prøven i mange mikroreaktorer, som hver indeholder et diskret antal målmolekyler [139, 140].Digitale assays giver betydelige fordele ved at udføre absolut kvantificering ved at udføre tusindvis af parallelle biokemiske eksperimenter samtidigt og individuelt i mikronskala rum snarere end i en kontinuerlig fase.Sammenlignet med traditionel mikrofluidik kan rumreaktioner reducere prøvevolumen, øge reaktionseffektiviteten og nemt integreres med andre analytiske metoder uden behov for kanaler, pumper, ventiler og kompakte designs [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Følgende to metoder bruges i digitale assays for at opnå ensartet og nøjagtig adskillelse af opløsninger, herunder reagenser og prøver såsom celler, nukleinsyrer og andre partikler eller molekyler: (1) dråbeemulsioner, der udnytter væskegrænsefladeustabilitet;(2) array-deling udføres af enhedens geometriske begrænsninger.I den første metode kan dråber indeholdende reagenser og prøver i mikrokanaler skabes ved passive metoder såsom medstrøm, krydsflow, flowfokusering, trinvis emulgering, mikrokanalemulgering og membraner gennem viskøse forskydningskræfter og emulgering med kanalændring.lokalisering [143, 145, 146, 148, 149] eller ved hjælp af aktive metoder [150, 151], som indfører yderligere energi gennem elektrisk, magnetisk, termisk og mekanisk styring.I sidstnævnte tilgang deles den bedste væskevolumenens ensartethed i mikrofluidkamre ved at holde rumlige strukturer af samme størrelse, såsom mikropits og overfladearrays [152,153,154].Især er dråber store flowsektioner, der også kan genereres og manipuleres på elektrodearrays baseret på digital mikrofluidik (DMF).Elektrobefugtning af dielektrikum er en af ​​de bedst undersøgte DMF-teorier, da elektrobefugtning af dielektrika tillader præcis manipulation af individuelle dråber, kontrollerer formen af ​​væsken og asymmetriske elektriske signaler, der passerer gennem forskellige sider [141, 144].De vigtigste operationer med dråber i DMF omfatter sortering, spaltning og sammensmeltning [151, 155, 156], som kan anvendes i forskellige analyseområder, især i molekylær detektion [157, 158, 159].
Digital nukleinsyredetektion er en tredjegenerations molekylær diagnostisk teknologi efter konventionel PCR og kvantitativ real-time PCR (qPCR), parallelt med high-throughput sekventering og flydende biopsi.I de sidste to årtier har digitale nukleinsyrer udviklet sig hurtigt inden for molekylær diagnostik af infektiøse patogener [160, 161, 162].Absolut kvantificering af digital nukleinsyredetektion begynder med pakning af prøver og reagenser i individuelle rum for at sikre, at hver målsekvens har samme sandsynlighed for at komme ind i hvert enkelt rum.Teoretisk set kan hver sektion være tildelt flere målsekvenser, eller der er muligvis ikke et uafhængigt mikroreaktionssystem.Gennem de forskellige sansningsmekanismer beskrevet ovenfor kan rum med mikrobielle målsekvenser, der genererer signaler over en bestemt tærskel, visualiseres med det blotte øje eller med en maskine og mærkes som positive, mens andre rum, der genererer signaler under tærskelværdien, mærkes som positive .negative, som gør signalet for hver sektion til et boolesk.Ved at beregne antallet af oprettede rum og hastigheden af ​​positive resultater efter reaktionen kan de originale kopier af testprøverne matches ved hjælp af Poisson-fordelingsformlen uden behov for en standardkurve, som er nødvendig for rutinemæssige kvantitative analyser som f.eks. som qPCR.[163] Sammenlignet med traditionelle molekylære diagnostiske metoder har digital nukleinsyredetektion en højere grad af automatisering, højere analysehastighed og følsomhed, færre reagenser, mindre kontaminering og enklere design og fremstilling.Af disse grunde er brugen af ​​digitale assays, især dråbebaserede metoder, til molekylær diagnostik, der kombinerer amplifikations- og signaludlæsningsteknikker, blevet grundigt undersøgt under det kritiske udbrud af SARS-CoV-2.For eksempel beskriver Yin et al.[164] kombinerede digitale dråber og hurtige PCR-metoder til at detektere ORF1ab-, N- og RNase P-gener i SARS-CoV-2 i en mikrofluidisk chip.Navnlig var systemet i stand til at identificere et positivt signal inden for 115 sekunder, hvilket er hurtigere end konventionel PCR, hvilket indikerer dets effektivitet i point-of-care-detektion (figur 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] og Alteri et al.[167] anvendte også droplet digital PCR (ddPCR) til at detektere SARS-CoV-2 i et mikrofluidisk system med imponerende resultater.For yderligere at forbedre detektionshastigheden, Shen et al.[168] opnåede ddPCR-baseret chip-billeddannelse på så lidt som 15 s uden brug af billedstikningsteknikker, hvilket fremskyndede ddPCR-teknologiprocessen fra laboratorium til applikation.Ikke kun termiske amplifikationsmetoder såsom PCR anvendes, men også isotermiske amplifikationsmetoder bruges til at forenkle reaktionsbetingelser og hurtig respons.Lu et al.[71] udviklede SlipChip til dråbeanalyse, der er i stand til at generere dråber af forskellige størrelser ved høje tætheder i ét trin og kvantificere SARS-CoV-2-nukleinsyrer ved hjælp af digital LAMP (Figur 7b).Som en hurtigt udviklende teknologi kan CRISPR også spille en vigtig rolle i digital nukleinsyredetektion gennem praktisk kolorimetrisk billeddannelse uden behov for yderligere nukleinsyrefarvninger.Ackerman et al.udviklet en kombinatorisk matrixreaktion til multipleksevaluering af nukleinsyrer.[158] påviste 169 human-associerede vira, inklusive SARS-CoV-2, i dråber indeholdende CRISPR-Cas13-baserede nukleinsyredetektionsreagenser i et mikrobrøndsassay (figur 7c).Derudover kan isotermisk forstærkning og CRISPR-teknologi bruges i det samme system for at kombinere fordelene ved begge.Park et al.[169] Et digitalt CRISPR/Cas12a-assay blev udviklet i en kommerciel mikrofluidisk chip til påvisning af ekstraheret og varmedræbt SARS-CoV-2 baseret på en enkelttrins RT-RPA med en kortere og højere signal-til-baggrund detektion tidsforhold., bredere dynamisk område og bedre følsomhed (fig. 7d).Nogle beskrivelser af disse eksempler er givet i tabel 3.
Typisk digital platform til nukleinsyredetektion.a Den hurtige digitale PCR-arbejdsgang består af fire nøgletrin: prøveforberedelse, distribution af reaktionsblandingen, amplifikationsproces og målkvantificering (tilpasset fra [164]).b Skematisk, der viser analyse af SlipChip-dråber til dråbedannelse ved høj tæthed (tilpasset fra [71]).c CARMEN-Cas workflowdiagram13 (tilpasset fra [158]).d Oversigt over avanceret digital virusdetektion med CRISPR/Cas i én gryde (tilpasset fra [169]).Uden vand-i-olie, polydimethylsiloxan PDMS, PCR polymerase kædereaktion, DAQ dataindsamling, PID proportional integral derivat, CARMEN kombinatorisk matrix reaktion til multipleks nukleinsyre evaluering, SARS-CoV-2, alvorligt akut respiratorisk syndrom, coronavirus 2, RT Amplifikation af revers transkriptase rekombinase polymerase-RPA, S/B signal i baggrunden